犬尿道瘢痕组织中TGFβ1和MMP1表达的研究

【摘要】  　　目的 探讨犬尿道瘢痕组织中转化生长因子β1(TGFβ1)和基质金属蛋白酶1(MMP1)的表达及其意义。方法 选取12只健康雄性成年犬，采用小儿电切镜制作犬尿道狭窄动物模型，应用免疫组织化学方法检测犬尿道狭窄段瘢痕组织中TGFβ1和MMP1的表达，以实验组犬尿道狭窄远端2cm处正常尿道组织作为对照组。结果 TGFβ1在实验组犬尿道瘢痕组织与对照组的阳性表达率分别为100.00%与18.18%，两者差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP1在实验组犬尿道瘢痕组织与对照组的阳性表达率分别为63.64%与9.09%，两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 TGFβ1和MMP1与犬尿道瘢痕形成关系密切。

【关键词】  尿道狭窄 转化生长因子β1 基质金属蛋白酶 1 免疫组织化学

　　The expression of TGFβ1 and MMP1 in the canine urethral scar tissue

　　Cao Jun, Li Jianping, Cheng Wei, Chen Qi, Deng Wanglong, Shen Yuyong

　　(Department of Urology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective  To investigate the expressions of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) and matrix metalloproteinase1 (MMP1) in the canine urethral scar tissue. Methods  Selecting 12 grown healthy male canines in this study, we established a urethral stricture model of canines by using the paediatric resectoscope. On the 31th day we obtained the samples of the urethral scar from the canines. Then we analyzed the expressions of TGFβ1 and MMP1 in the specimen with immunohistochemistry, which were compared with those in the tissue of normal canine urethra 2cm away from urethral scar. Results  The expression ratio of TGFβ1 was 100.00% in the canine urethral scar tissues, but was 18.18% in the tissues of the control group. The difference was significant (P<0.05). The expression ratio of MMP1 was significantly higher (63.64%) in the canine urethral scar tissues than in the tissues of the control group (9.09%) (P<0.05). Conclusion  The TGFβ1 and MMP1 are responsible for producing canine urethral scars.

　　KEY WORDS: urethral stricture; TGFβ1; MMP1; immunohistochemistry

　　  随着腔镜技术的发展，医源性尿道狭窄发生的比例不断增加，尿道狭窄的形成机制尚不十分清楚。目前认为主要是成纤维细胞、细胞因子和细胞外基质之间相互作用的过程，有多种细胞因子参与并发挥作用,它们调控着成纤维细胞的增殖与代谢,影响细胞外基质的形成与降解[1]。为了探讨尿道狭窄的形成机制，我们利用电切镜制作犬尿道狭窄动物模型，通过免疫组织化学技术检测犬尿道瘢痕组织中转化生长因子β1(transform growth factor β1, TGFβ1)和基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase1, MMP1)的表达水平，明确其在尿道狭窄形成过程中的作用及意义,初步探讨尿道狭窄发生的分子生物学机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  尿道狭窄模型的建立  选取12只健康雄性成年犬，分批用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉，采用好克N4210(0°、F10)小儿电切镜，电切功率30W，50g/L葡萄糖液冲洗，直视下置镜深度5～6cm，用直径2mm环状电极于前尿道5～7点行电切术，造成面积约2mm×3mm穿透尿道全层的手术创面，术后3d 1只犬死亡，其他11只犬继续饲养1月。术后第31天时麻醉动物，行尿道造影和尿道镜检，证实典型环状尿道狭窄形成，活体采集尿道狭窄组织标本，标本用10%(体积分数)甲醛溶液固定、石蜡包埋后5μm厚连续切片。

　　1.2  免疫组织化学检测

　　1.2.1  主要试剂  兔抗TGFβ1及兔抗MMP1多克隆抗体，由北京博奥森生物技术有限公司提供；生物素标记二抗，由北京博奥森生物技术有限公司提供；SP系列试剂盒由美国ZYMED公司提供。

　　1.2.2  免疫组织化学染色(SP法)  严格按照试剂盒说明操作。主要染色步骤: 切片常规脱蜡和水化；3%(体积分数)过氧化氢溶液室温孵育10min；正常山羊血清封闭；滴加多克隆抗体TGFβ1(原液稀释至1/200)，37℃下孵育90min；滴加生物素化二抗及SP复合液，37℃孵育30min；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，树胶封片。

　　1.2.3  对照设计  用已知人尿道狭窄瘢痕组织TGFβ1和MMP1阳性切片作阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

　　1.2.4  结果判断  显微镜下观察，以细胞膜和(或)细胞浆染成棕黄色作为阳性判断标准, 每张切片于400倍镜下随机选择5个视野，计数阳性成纤维细胞，无阳性细胞或阳性细胞百分率小于5%判为阴性(-)，阳性细胞百分率大于5%判为阳性(+)。

　　1.3  统计学处理  实验数据经SPSS 13.0统计软件处理，采用Fishers确切概率法检验进行统计学分析，检验水准：α=0.05。

　　2  结    果

　　2.1  实验犬尿道瘢痕组织形态学观察  与对照组正常犬尿道光镜下的组织形态结构相比，实验犬尿道电切损伤部位管腔上皮变薄、易脱落，固有层不连续，大量结缔组织填充且其内可见较多细胞成分，同时可见较多炎性细胞浸润。VG染色切片光镜下观察，胶原纤维呈红色，于细胞间散在分布，尿道瘢痕组织中胶原纤维粗大，密集成束或成行状排列。

　　2.2  实验犬尿道瘢痕组织与正常尿道组织中TGFβ1的表达  正常犬尿道组织中TGFβ1阳性颗粒分布于少量成纤维细胞内，染色弱, 犬尿道瘢痕组织中TGFβ1阳性表达的黄色颗粒，主要分布于成纤维细胞的胞浆内及细胞外基质中，且染色强，面积大，间质血管内皮细胞内也可见微弱的阳性染色(图1)。11只实验组犬尿道狭窄瘢痕中，TGFβ1阳性表达率为100%；在狭窄远端正常尿道组织中，TGFβ1阳性表达率为18.18%(2/11)，经Fisher确切概率法统计分析表明，P=0.000，按α=0.05水准，认为犬尿道狭窄瘢痕组织与犬正常尿道组织相比有统计学意义。

　　2.3  实验犬尿道瘢痕组织与正常尿道组织中MMP1的表达  正常犬尿道组织中MMP1的表达阳性颗粒少，分布于细胞胞浆内；犬尿道瘢痕组织内染色强，MMP1阳性颗粒广泛分布于胞浆内，少量分布于细胞外基质中(图2)。在11只实验组犬尿道狭窄瘢痕组织中，MMP1阳性表达率为63.64%(7/11)；狭窄远端正常尿道组织MMP1阳性表达率为9.09%(1/11)，经fisher确切概率法统计分析表明，P=0.024，按α=0.05水准，认为犬尿道狭窄瘢痕组织与犬正常尿道组织相比有统计学意义。

　　3  讨    论

　　1994年Bosnjakovic等[2]利用犬尿道狭窄模型，研究了尿道内支架植入疗效；Jadane[3]利用兔尿道狭窄模型研究了药物对兔尿道狭窄发生及复发的防治效果；2007年国内萧聪勤[4]首先报道在小儿尿道镜下，使用高频电刀和激光制作不同程度的尿道创伤，研究兔尿道创伤修复模型瘢痕中TGFβ1变化。我们选择雄犬制作尿道狭窄动物模型，经尿道造影和尿道镜检证实成功形成了尿道瘢痕狭窄环，病理及免疫组织化学检测结果符合瘢痕组织的基本生物学特征。在尿道瘢痕的基础研究当中，成纤维细胞是关键的效应细胞，在肉芽形成、基质合成、瘢痕形成方面均起重要作用，成纤维细胞可合成Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型胶原及纤维连结蛋白。尿道狭窄的病理学改变是创面过度修复，产生增生性瘢痕，进而破坏尿道的完整性，造成功能的障碍，尿道瘢痕的实质是以成纤维细胞增殖旺盛并分泌大量细胞外基质, 导致胶原的过量合成和沉积为特征，而难以被机体吸收或重塑的病理状态[5]。

　　我们在HE、VG染色中通过对犬正常尿道和尿道狭窄瘢痕的比较，发现犬尿道狭窄的瘢痕中可见大量的细胞堆积,主要为成纤维细胞，海绵体部的尿道瘢痕组织并非局限于狭窄段,而向两侧正常组织中延伸，这是我们在手术中无法把尿道瘢痕切除的主要原因，而尿道瘢痕中成纤维细胞的增殖与瘢痕软化过程、瘢痕反复发生之间的关系值得进一步研究。

　　在瘢痕形成过程中成纤维细胞的生物学效应主要受细胞因子的调控，如转化生长因子(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)等。TGFβ1是目前已知的与瘢痕过度形成关系最为密切的细胞因子，可增加胶原、纤连蛋白、透明质酸酶等细胞外基质的合成，诱导新生血管生成，激活成纤维细胞产生胶原蛋白，促进肉芽组织形成，影响创面愈合过程的所有阶段包括炎症反应和基质沉积。TGFβ1水平的改变在多种纤维化疾病中均存在[6]。

　　我们在免疫组织化学实验中发现，TGFβ1在犬尿道狭窄瘢痕中阳性颗粒有广泛的分布，主要集中于成纤维细胞胞浆中，证实了TGFβ1的高表达与瘢痕形成的密切关系。这与Wang等[7]报道的TGFβ1在瘢痕组织中高水平表达结果也是一致的。我们推测抑制尿道损伤后TGFβ1的表达水平, 将有可能抑制瘢痕组织的形成, 从而为预防尿道损伤后狭窄提供一种新的治疗思路。

　　病理性瘢痕发生的根本原因是创面修复过程中，胶原等细胞外基质形成与降解之间的动态平衡遭到破坏，导致细胞外基质过度沉积。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组参与细胞外基质降解的蛋白酶，其中基质金属蛋白酶1(MMP1)是MMPs家族的重要一员，是Ⅰ、Ⅲ型胶原降解的关键酶,其以酶原形式被分泌并释放到细胞外基质，经激活后参与胶原等细胞外基质的降解，故又名胶原酶[8]。

　　MMP1通过裂解胶原、改变胶原的结构以及细胞间的亲合力，参与细胞外基质的降解，MMP1的表达受多种因素的调控，如激素、生长因子和细胞因子，TGFβ1对MMP1起着抑制作用；细胞外过量沉积的胶原也可诱导MMP1的大量表达。从理论上讲，过量表达的MMP1可促使Ⅰ、Ⅲ型胶原降解，抑制病理性瘢痕的形成，但由于一些胶原酶抑制物的存在，使其降解胶原的作用明显减弱，尤其是金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase1, TIMP1)的增高，抑制了MMP1降解胶原的活性；TIMP1是组织中主要的MMP1活性的内生抑制物，对胶原酶的抑制作用最强[9]。在本实验当中，可以看到MMP1在尿道瘢痕中的表达较对照组正常尿道为高，但其增高程度没有TGFβ1明显，虽然MMPI在尿道瘢痕中高表达，但其降解胶原的作用明显减弱，导致胶原合成与分解失衡,胶原不断沉积,瘢痕形成。

　　病理性瘢痕形成是金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂及生长因子相互作用失衡的结果，在创伤修复的某个时相，对生长因子、金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂相互作用的某些环节加以干预，使MMP1活性增强，或使TIMP1表达减少，促进胶原等细胞外基质降解，则有望能抑制病理性瘢痕的形成[10]，然而它们之间的平衡作用机制还有待进一步阐明。

　　尿道瘢痕的形成是多因素相互作用的结果，它与成纤维细胞、胶原、生长因子及胶原酶等密切相关，瘢痕的形成涉及多种因素，TGFβ1、MMP1高表达只是其中之一，可能还与成纤维细胞膜上生长因子受体表达增多,成纤维细胞的凋亡发生异常等因素有关，认清其相互作用的机制，对于我们探索尿道狭窄的科学防治意义重大。

【参考文献】
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[3]Andersen HL, Duch BU, Gregersen H, et al. The effect of the somatostatin analogue lanreotide on the prevention of urethral strictures in a rabbit model [J]. Urol Res, 2003, 31:2531.

[4]萧聪勤. 兔尿道创伤修复模型瘢痕中TGFβ1变化的实验研究 [J]. 广州医药, 2007, 38(5):4950.

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[6]程伟，孙润芹，呼冬利，等. 人尿道狭窄瘢痕组织中胶原蛋白含量和TGFβ1表达的意义[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(2):207.

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[8]郭丽丽，刘林嶓，陈言汤. 基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂1、增殖细胞核抗原在病理性瘢痕中的表达 [J]. 中国美容医学, 2005, 14(5):544546.

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作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004