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摘要：目的：从实验方面对支原体颗粒治疗小儿肺炎支原体感染的疗效和作用机制进行系统的观察和研究。方法：选用Wistar大鼠，制作肺炎支原体感染模型；选昆明系小鼠制作相应模型，用支原体颗粒与利君沙对照。药效学研究：1.观察支原体颗粒对感染后大鼠肺炎支原体的清除作用。2.观察支原体颗粒对皮下注射内毒素粗制液后小鼠肛温变化的影响，研究支原体颗粒的解热作用。3.采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法研究支原体颗粒的抗炎作用。4.采用氨气刺激法研究支原体颗粒对小鼠的止咳作用。5.腹腔注射酚红溶液，研究支原体颗粒的化痰作用。药理学研究：1.观察感染后大鼠T细胞亚群、血液流变学和肺部病理的变化。2.观察感染后大鼠血清一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）含量的变化。结果：支原体颗粒有显著的抗肺炎支原体、解热、抗炎、止咳、化痰作用，并有显著的抗氧化、活血化瘀、改善肺部病理表现、调节免疫功能的作用。结论：支原体颗粒对小儿肺炎支原体感染具有良好的治疗作用。
关键词：肺炎支原体感染；支原体颗粒；实验研究
肺炎支原体感染是儿科急性呼吸道感染的常见病因，约占小儿呼吸道感染的10 ％～30 %，其临床表现多样，主要为急性呼吸道感染，由轻型到严重的致死性肺炎均可见到，并且可以引起多系统、多器官的肺外并发证。通过实验研究证明，支原体颗粒对小儿肺炎支原体感染具有良好的治疗效果。
1 材料
1.1 药品
肺炎支原体国际标准株，购于首都儿科研究所； 0.3 g/mL支原体颗粒浓缩液，山东中医药大学中药制剂室生产，批号：20041130；利君沙，西安利君沙股份有限公司生产，国药准字号：H61021713。
1.2 动物
健康Wistar 大鼠、昆明系小鼠，由山东中医药大学动物中心提供，批号：SCXK鲁20030004。
2 方法与结果
2.1 支原体颗粒的抗肺炎支原体作用
体重180～200 g健康雄性Wistar 大鼠50只，按体重随机分为正常组、模型组、对照组、中药小剂量组、大剂量组，每组各10只。经ELISA方法检测大鼠血清中支原体抗体均为阴性。除正常组外，其余4组用乙醚麻醉后，用1 mL注射器一次性滴鼻肺炎支原体菌液0.1 mL(含肺炎支原体107 CCU/mL)，利用大鼠的自然呼吸将菌液全部吸入肺中，造成感染模型。感染第11 d，采用大鼠舌下分泌物查PCR，验证造模成功（见图1和图2）。
图1 治疗前大剂量组、小剂量组、利君沙组、模型组PCR（略）
图2 治疗前空白组PCR （略）
注：阳性者呈明显曲线，阴性者近于直线。
正常组和模型组于造模11 d后用生理盐水1.5 mL/100 g，灌胃12 d；对照组用利君沙水溶液0.19 mg/kg灌胃，喂3 d停4 d，连续2周；中药大剂量组用支原体颗粒浓缩液1 mL/(次·只)，即0.07 g/10 g，连续灌胃2周；小剂量组用支原体颗粒浓缩液0.5 mL/(次·只)，即0.035 g/10 g，连续灌胃2周。2周后，用10 ％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取少量肺组织，生理盐水漂洗并充分研磨，送山东中医药大学附属医院生化室查PCR。
实验结果显示，对肺炎支原体的清除率，中药大剂量组90 ％，小剂量组80 ％，利君沙组80 ％。经SAS检验，中药大剂量组、小剂量组、对照组和模型组比较，P＜0.05，说明三组均有抗肺炎支原体的作用；中药大剂量组、小剂量组和对照组两两比较，P＞0.05，无明显差异（见图3）。
2.2 支原体颗粒的解热作用
取体重18～28 g的昆明系小鼠40只，雌雄不拘，随机分为4组，测每只小鼠正常直肠温度。其中一组给支原体颗粒0.45 g/100 g，配制成浓度0.3 g/mL的支原体颗粒溶液，灌胃量为1.5 mL/100 g；一组给支原体颗粒0.225 g/100 g，配制成浓度0.15 g/mL的支原体颗粒溶液，灌胃量为1.5 mL/100 g；余下两组等容量分别给以生理盐水和利君沙水溶液灌胃。20 min后皮下注射内毒素粗制液0.1 mL/kg，间隔20 min后测直肠温度（见表1）。
表1 支原体颗粒对内毒素所致小鼠发热的抑制作用（略）
注：与生理盐水组比较*P＜0.05；与大剂量组比较△P＜0.05
经SAS检验，三组与生理盐水组比较，均P＜0.05；表明支原体颗粒和利君沙都有抑制小鼠体温升高的作用。支原体颗粒大剂量组与利君沙组及小剂量组比较，P＜0.05，表明大剂量支原体颗粒的疗效优于利君沙及小剂量支原体颗粒。
2.3 支原体颗粒的抗炎作用
取昆明种小鼠40只,雌雄各半,体重18～22 g,随机分成利君沙组、中药小剂量组、大剂量组、生理盐水组。每组小鼠分别灌胃相应药液。连续给药5 d，末次给药后1 h，给小鼠左耳涂二甲苯0.05 mL致炎，右耳作正常对照，1 h后处死小鼠，以左耳重量减去右耳重量为肿胀度，比较药物的抗炎作用（见表2）。
表2 支原体颗粒对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制作用（略）
注：与生理盐水组比较★P＜0.05；与中药小剂量组比较●P＜0.01
2.4 支原体颗粒的止咳作用
取昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重20～25 g，随机分成利君沙组、中药小剂量组、大剂量组、生理盐水组。禁食不禁水12 h后,每组分别灌胃相应药液。灌胃给药0.5 h后,分别将40只小鼠(各组10只)置3000 mL密封的玻璃容器内,每次均恒压喷雾25 %～28 %浓氨水30 min，刺激小鼠致咳，30 min后取出动物,从小鼠第一次咳嗽起，每2 min观察咳嗽次数及咳嗽潜伏期，求t值并进行比较（见表3）。
表3 支原体颗粒对小鼠的止咳作用（略）
注：与生理盐水组比较★P＜0.01；与利君沙组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与小剂量组比较●P＜0.05
2.5 支原体颗粒的化痰作用
取体重20～25 g小鼠40只，雌雄各半，随机分为中药大剂量组、小剂量组、利君沙组、生理盐水组，每组10只。灌胃给药7 d，末次为禁食不禁水12 h后给药。末次给药0.5 h后，腹腔注射酚红溶液0.2 mL/10g，注射后0.5 h用湿布堵住小鼠口鼻，令其窒息死亡。将小鼠仰位固定，剥离气管，用小动脉夹夹住自甲状软骨至气管分支处的一段气管并剪下，放入盛有2 mL生理盐水试管中，再加0.1 mL NaOH，用分光光度计测定光密度值。根据标准曲线计算酚红含量（见表4）。
表4 支原体颗粒对小鼠气管酚红排泌量的影响（略）
注：与生理盐水组比较★P＜0.05；与利君沙组比较▲P＜0.05
2.6 支原体颗粒对感染大鼠血液流变学、T细胞亚群、肺部组织病理改变的影响
上述模型，经腹腔取8 mL肝素抗凝血。取6 mL肝素抗凝血静置0.5 h以上，检测温度25 ℃。以全自动血液流变快测仪分别测定全血高切、低切黏度、血浆高切黏度、红细胞电泳、红细胞压积。取两支试管，加入受检大鼠肝素抗凝血各100 μL，然后分别加入CD3/NK、CD4/CD8双色直标单克隆抗体各20 μL，充分混匀置室温(15～22 ℃)暗处20 min，各管加入溶血剂2 mL充分混匀，放置暗处10 min，2000 r/min离心5 min，倾去上清液，PBS液洗涤3次，再每管加PBS液0.5 mL，用SimulSET软件进行测定和分析，每次获取10000个细胞，用彩色打印机打印结果。取气管、肺部组织，用10 ％福尔马林固定，切片并在显微镜下观察。所有指标均在4 h内完成。
表5 各组大鼠红细胞压积、红细胞电泳的变化（略）
注：与模型组比较★P＜0.05，★★P＜0.01；与利君沙组比较▲P＜0.01；与中药小剂量组比较●P＜0.01
表6 大鼠全血高切黏度、低切黏度、血浆高切黏度的变化（略）
注：与模型组比较★P＜0.05；与利君沙组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表7 各组大鼠T细胞亚群的变化（略）
注：与正常组比较★P＜0.05；与利君沙组比较▲P＜0.01
表8 肺部组织病理改变（略）
注：与模型组比较★P＜0.01
利君沙组病变严重者少于模型组，但无统计学意义；中药大剂量组病变严重者明显少于模型组，具有非常显著性差异。模型组病理结果见图4、图5，利君沙组病理结果见图6、图7，中药小剂量组病理结果见图8、图9，中药大剂量组病理结果见图10、图11。图4可见支气管及肺小动脉周围有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润。图5可见间质性肺炎样改变，支气管壁增厚，管腔狭窄；支气管内上皮细胞脱落，有黏液样物质充斥；肺组织内有陈旧性出血。图6可见炎性假瘤形成，周围有毛细血管形成。图7可见支气管内仍有上皮细胞脱落，肺内有陈旧性出血存在，但肺泡间结缔组织减少。图8可见支气管内有分泌物充斥，肺间质可见慢性炎性细胞浸润，支气管壁增厚，管腔狭窄。图9同图4，但支气管内上皮细胞脱落消失。图10可见肺泡间质减少，支气管内无上皮脱落和黏液形成，基本接近正常肺组织。图11可见肺泡间质明显减少。
2.7 支原体颗粒对感染大鼠一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的影响
上述模型经腹腔取8 mL抗凝血，离心后取血清。取空白试管3支，分别加入100 μL大鼠肝素抗凝血清、蒸馏水和100 μmol/L标准应用液，37 ℃水浴60 min后，加入血清，充分漩涡混匀30 s，室温静置10 min，3500～4000 r/min离心10 min，取上清液显色，测各管吸光度值，计算NO含量。
另取空白试管3支，分别加入10 nmol/mL标准品、大鼠抗凝血清和无水乙醇，再加入混合试剂4 mL，用漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷却，3500～4000 r/min离心10 min，取上清液显色，测各管吸光度值，计算MDA含量。
表9 血清中NO和MDA含量（略）
注：与模型组比较★P＜0.05；与大剂量组比较▲P＜0.05
经SAS检验，NO含量：中药小剂量组、大剂量组、利君沙组与模型组相比，P＜0.05，说明三组均有疗效；中药大剂量组与小剂量组、利君沙组比较，P＜0.05，有显著性差异。MDA含量：中药大剂量组、小剂量组、利君沙组与模型组相比，P＜0.05，说明三组均有疗效；中药大剂量组与利君沙组、小剂量组相比较，P＜0.05，有显著性差异。
3 讨论
小儿肺炎支原体感染，好发于冬春季节，具有一定的流行性和传染性，临床表现与风温相似，病情演变遵循卫气营血的发展规律，疾病过程中容易出现化燥伤阴的征象，所以属于祖国医学“风温”范畴。现代医学认为其发病主要与肺炎支原体的黏附、上皮细胞的毒性变化、血液黏滞性增高、免疫调节机制异常等有关。
支原体颗粒是在古方贝母瓜蒌散（黄芩、瓜蒌、黄连、浙贝母、赤芍、百部、甘草）的基础上化裁而来。实验结果表明：该药能够显著地清除肺炎支原体，有显著的抗病原微生物作用；有明显的解热作用；能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，有显著的抗炎作用；能够显著延长用氨水引咳小鼠的咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，有显著的止咳作用；能够使感染大鼠呼吸道黏膜酚红排泌量增加，具有较强的化痰作用；能够显著提高MP感染大鼠的细胞免疫水平，使治疗后大鼠CD3、CD4上升，CD4/ CD8比值升高，从而解除细胞免疫功能受到的抑制，使辅助T细胞和抑制T细胞处于相互协调平衡，从而维持机体内环境的平衡；能够明显改善感染大鼠的肺部组织病理表现；能够明显降低感染大鼠的红细胞压积、全血还原黏度和血浆黏度，缩短红细胞电泳时间，改善微循环；能够降低感染大鼠体内的MDA和NO含量，减轻氧自由基的损伤。所以，支原体颗粒对小儿肺炎支原体感染具有可靠、良好的治疗作用。
图3 治疗后PCR检查结果 （略）
图4 模型组病理结果图（略）
图5 模型组病理结果图（略）
图6 利君沙组病理结果图（略）
图7 利君沙组病理结果图 （略）
图8 中药小剂量组病理结果图（略）
图9 中药小剂量组病理结果图（略）
图10 中药大剂量组病理结果图（略）
图11 中药大剂量组病理结果图 （略）
（山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011；烟台市中医医院，山东 烟台 264000）