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Home医源资料库在线期刊齐鲁医学杂志2006年第21卷第1期

人疱疹病毒6型101K被膜蛋白主要抗原决定簇区原核表达克隆的构建和表达

来源:齐鲁医学杂志
摘要:[摘要]目的构建人疱疹病毒6型(HHV6)101K被膜蛋白的原核高效表达克隆,并进行原核表达。方法PCR扩增HHV6B101K被膜蛋白的主要抗原决定簇区(666~834aa)编码基因片段(nt2347~2853),并导入T载体进行测序,与GenBank中HHV6标准毒株序列比较以进一步鉴定。目的基因及表达载体pThioHisA分别经双酶切后连接......

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  [摘要]  目的  构建人疱疹病毒6型(HHV6)101K被膜蛋白的原核高效表达克隆,并进行原核表达。方法PCR扩增HHV6B 101K被膜蛋白的主要抗原决定簇区(666~834aa)编码基因片段(nt2 347~2 853),并导入T载体进行测序,与GenBank中HHV6标准毒株序列比较以进一步鉴定。目的基因及表达载体pThioHis A分别经双酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21,应用PCR法及限制性核酸内切酶双重鉴定原核表达质粒,并经测序证实。IPTG诱导蛋白表达,SDSPAGE电泳鉴定重组蛋白。结果  PCR获得的目的基因序列与GenBank中HHV6B标准毒株Z29序列一致,重组质粒诱导菌表达产物出现相对分子质量为31 900的融合蛋白条带。结论HHV6 101K蛋白的原核表达克隆构建和表达成功,为进一步完善HHV6活动性感染的血清学诊断提供了实验基础。

  [关键词]  疱疹病毒6型,人;101K被膜蛋白;基因表达

  CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF PROKARYOTIC EXPRESSIVE CLONE OF HUMAN HERPES VIRUS 6 101K TEGUMENT PROTEIN MAJOR ANTIGEN EPITOPES

  YAN LIPING, WANG YUN, WANG XIAOFENG,  et al

  (Department of Clinical Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266021,  China)
 
  [ABSTRACT]ObjectiveTo construct prokaryotic expression clones of human herpes virus 6 (HHV6) 101K protein genes.MethodsA fragment coding for HHV6 101K major antigen epitopes (666-843 aa) was amplified by PCR technique. The PCR products were cloned into TA cloning vector for sequencing and subsequently compared with the sequence of HHV6B Z29 strain in GeneBank. The target gene was inserted into the prokaryotic expression plasmid pThioHis A. After the transformation of E. coli BL21, the recombinant plasmid was induced with IPTG to express the 101K fusion proteins. Recombinant prokaryotic expression plasmid was confirmed by PCR and restricted endonuclease analysis and the recombinant protein was confirmed by SDSPAGE. ResultsThe sequence of the target gene was identical with that of HHV6B Z29 strain in GenBank. The relative molecular weight 31 900 fusion proteins were expressed in E. coli BL21.ConclusionThe successful construction of recombinant prokaryotic expression plasmid and expression of the recombinant protein provides valuable information for the diagnosis of active HHV6 infection.

  [KEY WORDS]herpesvirus 6, human; 101K tegument protein; gene expression
   
  人疱疹病毒6型(HHV6)是一种对T淋巴细胞具有高度亲嗜性的新型β疱疹病毒亚群,与其他疱疹病毒一样,HHV6原发感染后可在人体内长期存在,通常以潜伏感染的形式与机体处于动态平衡中,当机体免疫功能下降或免疫抑制状态下可被激活,导致各种活动性感染。目前应用ELISA法检测病人血清中特异性抗体是诊断HHV6感染最为常用的方法,但所用抗原多为应用细胞培养方法制备的全病毒抗原,因含有细胞蛋白成分而影响到抗体检测的特异性和敏感性,且目前国内尚无该类试剂,国外试剂价格昂贵,不能广泛应用于临床检测。本研究通过DNA重组技术,选取HHV6B特异性免疫原性101K蛋白主要抗原决定簇相应编码区段,构建原核重组表达载体,并用IPTG诱导蛋白表达,SDSPAGE电泳进行鉴定,为研制以基因工程抗原为主的新型HHV6 IgM ELISA诊断试剂提供了实验基础。

  1  材料和方法

  1.1  目的基因的选择

  研究证实,101K蛋白为HHV6B特异性免疫原性蛋白质,HHV6A相应位置编码蛋白称为P100, 二者的编码基因均定位于HHV6基因组11~15 kb处(U11),其编码产物均为病毒被膜蛋白,氨基酸的同源性高达81%[1~4]。因此构建原核重组载体表达101K或P100重组蛋白作为抗原检测IgG和IgM抗体,可以用于HHV6A和HHV6B感染的诊断。HHV6B 101K基因的GenBank序列号为L13162,共3 190个碱基,第352~2 925位碱基为ORF,编码858个氨基酸。本研究采用DNAStar软件分析选择101K高度亲水的主要抗原决定簇区(666~834aa)的相应基因区段(2 347~2 853核苷酸,507 bp),作为目的基因。

  1.2  目的基因的获取与纯化

  1.2.1  目的基因特异性引物的设计及合成  根据HHV6B 101K编码基因序列,用DNAStar软件设计合成扩增目的基因的特异性引物,并在上游引物的5′端引入限制性核酸内切酶KpnⅠ的酶切位点(GGTACC)和保护碱基GTC,在下游引物的5′端引入限制性核酸内切酶SalⅠ酶切位点(GTAGAC)和保护碱基CAC。引物由北京赛百盛生物技术公司合成,扩增产物长为528 bp,引物序列如下:senseprimer:5′GTCGGTACCGCAGCGAGTTAACAAGATTCTA3′;antisenseprimer:5′CACGTCGACTCTTCATCAGTTTCCCCGTCTTG3′。

  1.2.2  目的基因的PCR扩增  经优化选择后,按以下条件进行PCR扩增,PCR反应体积为50 μL,反应体系为10×buffer 5 μL,其中MgCl2浓度为1.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,上下游引物浓度0.5 μmol/L,DNA模板2 μL。PCR循环条件为:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。同步设立阴性对照(JJhan细胞DNA)和水对照。PCR扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳,紫外线透射仪下观察结果。

  1.2.3  目的基因PCR扩增产物的纯化  按QIAquick PCR纯化试剂盒说明进行。

  1.2.4  目的基因的序列鉴定  将PCR产物插入高效克隆载体pMD18T载体,进行DNA序列鉴定。

  1.3  原核表达载体pThioHis A制备与纯化

  应用TSS两步法,将载体pThioHis A转化新鲜制备的E.coli BL21感受态细菌,以获得大量的载体。应用碱裂解法提取质粒DNA,并用酚氯仿抽提纯化。

  1.4  重组原核表达质粒的构建

  1.4.1  目的基因和载体pThioHis A的酶切及回收  PCR产物及载体pThioHis A分别同时用限制性核酸内切酶KpnⅠ和SalⅠ双酶消化,反应体系如下:DNA样品1.0 μg,10×T buffer 2 μL,1 g/L BSA 1 μL,KpnⅠ 2 U,SalⅠ 2 U,用ddH2O补至20 μL,轻敲管壁混匀上述液体,37 ℃温浴4 h。用8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,待DNA完全消化后(电泳显示单一条带),用QIAquick PCR纯化试剂纯化回收酶切产物。

  1.4.2  载体与目的基因的连接  将酶切后的载体和目的基因按1∶1、1∶2和1∶4的摩尔比混合,用T4 DNA Ligase 16 ℃过夜进行连接反应。

  1.4.3  重组原核表达质粒的转化  应用TSS两步法,将上述连接产物转化新鲜制备的E.coli BL21感受态细菌,在ALB(含氨苄青霉素100 mg/L)琼脂糖平板培养基上37 ℃培养18~24 h,观察菌落生长情况。同步设立阴性(仅有BL21敏化菌)和阳性对照(pThioHis A)。

  1.5  重组原核表达质粒的筛选及鉴定

  载体pThioHis A含有氨苄青霉素抗性基因,重组菌及含空载体菌均可在ALB琼脂糖平板培养基上生长。本研究将在ALB平板上生长的菌落,应用碱裂解法快速提取质粒DNA,然后以质粒(1∶500稀释)作为模板进行PCR鉴定。同时,应用限制性核酸内切酶KpnⅠ和SalⅠ双酶切消化质粒DNA 4 h,消化产物用8 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。再将PCR法和双酶切法双重鉴定的阳性克隆进行序列测定,以确定重组成功且其编码蛋白读码框架无误。

  1.6  重组克隆的诱导表达及表达蛋白的检测

  应用IPTG诱导重组克隆表达融合蛋白,并行150 g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳及考马斯亮蓝染色检测蛋白表达情况。

  2  结果

  2.1  目的基因的PCR扩增

  PCR扩增产物长度为528 bp,其中目的基因即101K编码基因特定区段为510 bp,引入扩增产物两端的限制性核酸内切酶识别位点序列及保护性碱基共18 bp。电泳结果如图1所示,同DNA标准分子质量参照物比较,PCR扩增产物的大小与预测结果一致。

  2.2  目的基因的序列鉴定

  将HHV6B 101K编码基因特定区段PCR扩增产物插入高效克隆载体pMD18T载体后进行测序,将结果与GenBank HHV6B Z29标准株101K编码基因相应序列进行对排分析,其碱基序列基本一致,证实确为HHV6B 101K编码基因的特定序列。

  图1  目的基因PCR扩增产物及重组质粒的酶切鉴定(略)

  M为DNA相对分子质量标准,①为目的基因的PCR扩增产物,②为重组质粒双酶切产物,③为重组质粒单酶切产物,④为阴性对照

  2.3  原核重组表达质粒的鉴定

  少量碱裂解法快速提取重组克隆质粒,PCR扩增重组质粒出现528 bp条带;重组质粒经限制性核酸内切酶KpnⅠ及SalⅠ双酶切消化,消化产物电泳后可观察到2条带,分别约为4.4 kb和528 bp,与预测结果一致(图1)。重组质粒经测序证实确为HHV6B 101K编码基因的特定序列,证明重组克隆构建成功且编码蛋白读码框架无误。

  2.4  表达融合蛋白的检测

  经过SDSPAGE蛋白电泳,考马斯亮蓝R250染色观察,含重组质粒的诱导菌在相对分子质量为31 900的位置出现一条蛋白条带,而未经诱导的重组质粒转化菌在相应位置的蛋白条带要弱得多,质粒对照pThioHis A的诱导菌则在相对分子质量为31 900的位置处未观察到蛋白条带。计算机对目的基因表达的多肽相对分子质量估计约为19 100,而质粒对照表达的配体氧硫还蛋白相对分子质量为12 800,融合蛋白的大小恰为两者之和,与理论预测值一致。另外,从蛋白带型来看,诱导3~4 h的融合蛋白表达量均较高,如图2所示。

  图2  SDSPAGE电泳分析HHV6 101K重组质粒原核表达产物(略)

  M为蛋白质相对分子质量标准,①为诱导的质粒对照,②~⑥分别为诱导5、4、3、2和1 h的重组质粒,⑦为未诱导的重组质粒,⑧为未诱导的质粒对照
  
  3  讨论

  HHV6与其他疱疹病毒一样,在人群中的感染率极高,约60%~90%的健康成人有HHV6感染的证据。越来越多的研究表明,HHV6与人类临床多种疾病的发生有关,如幼儿急疹、热惊厥、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症以及慢性疲劳综合征等,也是AIDS和器官移植等免疫功能低下病人较常见的病原体[1,5~9]。建立一种敏感特异、简单快速诊断HHV6感染的方法是深入研究HHV6致病性和临床检测的需要。血清学诊断是临床诊断HHV6感染最为常用的检测方法。目前HHV6特异性抗体ELISA检测所用抗原主要以细胞工程抗原为主,该类抗原系病毒各种蛋白的总和,并混有细胞蛋白成分,其敏感性及特异性较差。此外,需大量细胞用于病毒接种,实验周期较长,操作繁琐且成本较高。与细胞工程抗原相比,构建重组表达载体,利用大肠杆菌表达重组抗原具有操作简单、成本较低、抗原稳定性好且易于标准化等优点,因此国外已有重组HHV6抗原的研制,国内尚无此类研究报道。本研究采用基因工程技术构建了抗原性强和特异性高的重组蛋白表达克隆,为制备敏感特异、简单快速、价格适中的HHV6特异性IgM抗体的ELISA诊断试剂提供了实验基础。

  本研究中我们利用DNA Star软件在HHV6B 101K的C端区域选择亲水性强的第666~834aa编码基因为目的基因构建原核表达克隆,确保其表达蛋白具有较好的抗原性和水溶性,以期获得有实际应用价值的重组HHV6抗原。由于HHV6B 101K与HHV6A P100完全一致的氨基酸达81%,相近的氨基酸高达90%,故其免疫原性无组织特异性,均可作为抗原检测HHV6的感染。本研究以pThioHis A高效原核表达系统构建原核重组表达载体,通过IPTG诱导目的基因在BL21宿主菌中表达,经SDSPAGE电泳检测诱导表达情况,结果显示在相对分子质量31 900位置附近有一明显的蛋白条带。而未经诱导的转化菌及诱导的pThioHis A载体对照相应位置无蛋白条带,表明相对分子质量31 900的蛋白条带是重组诱导产生的氧硫还融合蛋白。融合蛋白的大小与理论预测值一致,为pThioHis A载体对照表达的相对分子质量12 800的氧硫还蛋白与目的基因预计表达的相对分子质量19 100的蛋白之和。从蛋白带形来看,诱导的时间长短对BL21表达目的蛋白的产量有影响,以诱导3~4 h融合蛋白表达量较为理想。

  本实验所用质粒pThioHis为高效原核表达系统,含功能性强的Trc(trplac)启动子,启动子下游含有硫氧还蛋白编码基因,可在IPTG诱导下激活下游序列及插入基因,在大肠杆菌BL21中大量表达高水溶性的硫氧还融合蛋白,其融合物N端的3个组氨酸(His)可折叠形成一个针对二价金属阳离子的高聚合域,故可利用镍螯合物琼脂糖树脂柱(ProBondTMresin)进行纯化。而且质粒pThioHis在硫氧还蛋白编码基因和多克隆位点间存在肠激酶切割位点(AspAspAspAspLys),肠激酶可水解赖氨酸和下一个氨基酸的多肽间连接,从而将融合蛋白中的氧硫还蛋白切割去除,分离得到纯的目的蛋白。下一步我们拟纯化融合蛋白,并应用肠激酶切割获得纯的目的蛋白,以获得抗原性和特异性良好的重组抗原。

  本研究中我们成功构建了HHV6B 101K蛋白编码基因重组克隆并表达了重组融合蛋白,进一步完善后可用于HHV6活动性感染的血清学诊断,为进一步研究开发新型HHV6诊断试剂提供理论依据和实验基础。

  [参考文献]

  [1]CORRAL I, QUEREDA C, PEREZELIAS M J, et al. Search for human herpesvirus 6 DNA in cerebrospinal fluid from AIDS patients with progressive multifocal leukoencephalopathy[J]. J Neurovirol, 2003,9:136.

  [2]SINGH N, CARRIGAN D R. Human herpesvirus6 in transplantation:an emerging pathogen[J]. Ann Inlern Med, 1996, 124:1065.

  [3]TEJADASIMON M V, ZANG Y C, HONG J, et al. Detection of viral DNA and immune responses to the human herpesvirus 6 101kilodalton virion protein in patients with multiple sclerosis and in controls[J]. J Virol, 2002,76:6147.

  [4]THOMSON B J, DEWHURST S, GRAY D. Structure and heterogeneity of the a sequences of human herpesvirus 6 strain variants U1102 and Z29 and identification of human telomeric repeat sequences at the genomic termini[J]. J Virol, 1994, 68:3007.

  [5]ACOTT P D, CROCKER J F, LEE S. Simulect and HHV6 in pediatric renal transplantation[J]. Transplant Proc, 2004, 36:S483.

  [6]DEBORSKA D, DURLIK M, SADOWSKA A, et al. Human herpesvirus6 in renal transplant recipients: potential risk factors for the development of human herpesvirus6 seroconversion[J]. Transplant Proc, 2003, 35:2199.

  [7]MARTIN M E, THMMSON B J, HONESS R W, et al. The genome of human herpesvirus 6:maps of unitlength and comcatemeric genomes for nine restriction endonucleases[J]. J Gen Virol, 1991,72:157.

  [8]SULIGOI B, DORRUCCI M, UCCELLA I, et al. Effect of multiple herpesvirus infections on the progression of HIV disease in a cohort of HIV seroconverters[J]. J Med Virol, 2003, 69:182.

  [9]YOSHIKAVA T, ASANO Y. Central nerous system complications in human herpesvirus6 infection[J]. BrainDev, 2000, 22:307.

  (本文编辑  马伟平)

  [基金项目]青岛市科技局资助项目(2001KNS2E271)

  (青岛大学医学院,山东 青岛  266022 第二附属医院检验科;微生物学教研室)

 

作者: 阎丽平,王云,王笑峰,罗兵
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