黄芪对新生儿脐血淋巴细胞凋亡的影响

　　［摘要］  目的  探讨黄芪（AM）对新生儿脐血淋巴细胞凋亡的影响及其作用机制。方法  随机选择30例正常足月新生儿为研究对象，收集并分离脐血单个核细胞（CBMC），体外分别经植物血凝集素（PHA）、PHA联合白细胞介素6 （IL6）、PHA联合AM刺激培养48 h，采用丫啶橙溴化乙锭（ABEO）染色法测定细胞凋亡水平，间接免疫荧光法测定CBMC中CD38阳性和CD25阳性细胞百分率，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清液中IL6的水平。结果  PHA+AM刺激组细胞凋亡率明显低于单纯PHA刺激组（F=205.91，q=25.16，P<0.001），PHA+IL6刺激组明显低于单纯PHA刺激组（q=24.54,P<0.001），而PHA+IL6刺激组与PHA+AM刺激组间细胞凋亡水平比较差异无显著性（q=0.62,P＞0.05）。PHA+AM刺激组CD38阳性细胞百分率明显低于单纯PHA刺激组（F=790.12，q=48.95,P<0.001），PHA+IL6刺激组也明显低于单纯PHA刺激组（q=48.42,P<0.001），但PHA+IL6刺激组与PHA+AM刺激组间比较差异无显著性（q=0.53,P>0.05）。PHA+AM刺激组CD25阳性细胞百分率明显高于单纯PHA刺激组（F=221.38，q=26.60,P<0.001），PHA+IL6刺激组也明显高于单纯PHA刺激组（q=24.86,P<0.001），但PHA+IL6刺激组与PHA+AM刺激组间比较差异无显著性（q=1.74,P＞0.05）。PHA+AM刺激组培养上清液中IL6水平明显高于单纯PHA刺激组(t′=6.50，P<0.001)。CBMC经48h培养后，凋亡细胞百分率与培养上清液中IL6浓度呈明显负相关（r=-0.75,P<0.05）。结论  黄芪能明显抑制CBMC体外经PHA激活后的细胞凋亡，其机制可能与促进CBMC中胸腺细胞向T淋巴细胞分化、增强脐血淋巴细胞活化和增加IL6产生水平等有关。

　　［关键词］  黄芪；胎血；细胞凋亡；淋巴细胞；抗原，CD38；受体，白细胞介素2；白细胞介素6；婴儿，新生

　　EFFECTS OF ASTRAGALUS MEMBRANACEUS ON THE APOPTOSIS OF CORD BLOOD LYMPHOCYTES IN NEONATES
　　WANG SHUJIE， ZHANG QIUYE，WANG MEI， et al

　　(Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effects of Astragalus Membranaceus (AM) on neonatal lymphocyte apoptosis in cord blood and to study the their mechanism. MethodsThirty fullterm neonates were enrolled in this study. Cord blood mononuclear cells (CBMC) were cultured in vitro with pure PHA, PHA combined with IL6 or AM, respectively, for 48 hours. The apoptosis indexes of lymphocytes of CBMC after cultivation were determined by ABEO dying method. The positive expression of CD38 antigen and CD25 antigen were detected by indirect immunofluorescence procedure.  The levels of IL6 in the supernatants of CBMC was detected by ELISA . ResultsThe apoptosis index (AI) of the PHA combined with AM group and the PHA combined with IL6 group were both lower than that of the pure PHA group (F=205.91；q=25.16, 24.54；P<0.001), but there was no difference between the AI of the PHA combined with IL6 group and that of the PHA combined with AM group (q=0.62,P>0.05). The positive expression of CD38 of the PHA combined AM group and the PHA combined IL6 group were all lower than that of the pure PHA group (F=790.12；q=48.95, 48.42；P<0.001), but there was no difference between the positive expression of CD38 of PHA combined with IL6 group and that of PHA combined with AM group (q=0.53,P>0.05). The positive expression of CD25 of the PHA combined AM group was higher than that of the pure PHA group (F=221.38，q=26.60,P<0.001), and the positive expression of CD25 of the PHA combined IL6 group was higher than that of the pure PHA group (q=24.86,P<0.001). But there was no difference between the positive expression of CD25 of the PHA combined with IL6 group and that of the PHA combined with AM group (q=1.74,P>0.05). The IL6 level in supernatants of CBMC of the PHA combined with AM group was significantly higher than that of the pure PHA group (t′=6.50,P<0.001). Cultured for 48 hours, the AI of CBMC had negative correlation with the level of IL6 of the supernatants (r=-0.75, P<0.05). ConclusionAM can significantly inhibit the apoptosis of CBMC after PHA stimulation in vitro. The possible mechanism may be that AM can increase the cell differentiation from thymocytes to T lymphocytes, enhance the activation of cord blood lymphocytes and increase the production of IL6 level.

　　［KEY WORDS］Astragalus Membranaceus; fetal blood；apoptosis, cell；lymphocytes；CD38 antigens； receptors, interleukin2；interleukin6； infant，newborn
   
　　新生儿免疫功能发育不成熟，尤以T淋巴细胞功能低下突出［1，2］，此虽为新生儿期的生理现象之一，但因其与新生儿期的易感性增高和感染易于扩散关系甚为密切而倍受关注。已有研究证实，新生儿脐血淋巴细胞凋亡增多且早产儿更为突出，后者与新生儿T淋巴细胞功能低下密切相关［3，4］。通过干预淋巴细胞凋亡来调节T淋巴细胞功能是新生儿免疫治疗的重要方法。黄芪(AM)是一种常用扶正中药，具有补气固表，增强机体抵抗力的作用。研究显示，黄芪中分离出的黄芪多糖（APS）对机体特异性与非特异性免疫功能有广泛的影响，能明显增强儿童T淋巴细胞体外增殖反应，上调Th1功能状态［5,6］，但目前尚无有关AM对淋巴细胞凋亡状态影响的报道。为此，本研究对新生儿脐血单个核细胞（CBMC）分别给予植物血凝集素（PHA）、PHA联合黄芪或白细胞介素6（IL6）诱导培养，观察黄芪对新生儿CBMC凋亡的影响，并对其作用机制进行探讨。现将结果报告如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象

　　正常足月顺产新生儿30例，男13例，女17例；胎龄37~41周；出生体质量2 500～4 000 g；出生无窒息史、无胎膜早破及宫内感染史。其母无异常妊娠史及血制品、免疫制剂应用史。

　　1.2  研究方法

　　1.2.1  标本采集  无菌方法采取新生儿脐静脉血5 mL，肝素抗凝。

　　1.2.2  CBMC分离与培养  密度梯度离心法分离CBMC，用RPMI 1640培养液配制成1×1010/L的细胞悬液。取200 μL上述细胞悬液，分别加入含PHA、AM+PHA和IL6+PHA的RPMI 1640培养瓶中。每个培养瓶内均有1.8 mL内含体积分数0.10的灭活小牛血清和20 μg PHA（终浓度均为10 mg/L）的RPMI 1640培养液，PHA+AM培养瓶中加入AM（终浓度1 g/L，按生黄芪计；AM水提剂由四川百利药业有限公司提供，生黄芪水提原液浓度为2 500 g/L），PHA+IL6培养瓶中加入IL6（终浓度10 μg/L）。培养体系中的AM和IL6浓度选择参照文献［7，8］。培养瓶放入37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养48 h，然后收集上清液300 μL于-20 ℃保存以备测，细胞悬液调细胞浓度为5×109/L备用。

　　1.2.3  细胞凋亡水平检测  采用丫啶橙溴化乙锭双染色形态观测法［4］。

　　1.2.4  CD25、CD38阳性细胞检测  采用单克隆抗体间接免疫荧光法。鼠抗人CD25单克隆抗体、CD38单克隆抗体由卫生部武汉生物制品研究所提供。

　　1.2.5  培养上清液中IL6的测定  采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书进行。试剂盒由深圳晶美生物制品公司提供。

　　1.3  统计学处理

　　采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。实验数据呈正态分布，以±s表示，组间比较采用方差分析及t′检验，两变量间相关分析采用直线相关分析法。

　　2  结果

　　2.1  CBMC中细胞凋亡水平的比较

　　经体外48 h培养后，PHA+AM刺激组细胞凋亡率为(16.48±3.45)%，PHA+IL6刺激组细胞凋亡率为(16.86±4.03)%,而单纯PHA刺激组细胞凋亡率为(32.42±2.82)%。3组比较差异有显著性（F=205.91，P<0.001），PHA+AM刺激组和PHA+IL6刺激组细胞凋亡率均明显低于单纯PHA刺激组（q=25.16、24.54,P<0.001），而PHA+IL6刺激组与PHA+AM刺激组间比较差异无显著性（q=0.62,P＞0.05）。

　　2.2  CBMC中CD38阳性细胞百分率比较

　　经体外48 h培养后，PHA+AM刺激组CBMC中CD38的阳性细胞百分率为（9.80±1.79）%，而PHA+IL6刺激组和单纯PHA刺激组分别为（9.94±0.62）%、（22.28±1.51）%，3组间比较差异有显著性（F=790.12，P<0.001），PHA+AM刺激组和PHA+IL6刺激组CD38阳性细胞百分率均明显低于单纯PHA组（q=48.95、48.42,P<0.001），但PHA+IL6刺激组与PHA+AM刺激组间比较差异无显著性（q=0.53,P＞0.05）。

　　2.3  CBMC中CD25阳性细胞百分率比较

　　经体外48 h培养后，PHA+AM刺激组CBMC中CD25的阳性细胞百分率为（83.20±2.44）%，而PHA+IL6刺激组和单纯PHA刺激组分别为（82.06±3.00）%和（65.78±4.86）%，3组比较差异有显著性（F=221.38，P<0.001）。PHA+AM刺激组和PHA+IL6刺激组CD25阳性细胞百分率均明显高于单纯PHA刺激组（q=26.60、24.86,P<0.001），而PHA+IL6刺激组与PHA+AM刺激组间比较差异无显著性（q=1.74,P＞0.05）。

　　2.4  CBMC培养上清液中IL6水平比较

　　PHA+AM刺激组CBMC培养上清液中IL6浓度为（253.01±30.80）ng/L，而单纯PHA刺激组仅为（37.86±12.15）ng/L。PHA+AM刺激组IL6产生水平明显高于单纯PHA刺激组(t′=6.50，P<0.001)。

　　2.5  IL6产生水平与细胞凋亡率的相关性分析

　　本文对PHA+AM刺激组和单纯PHA刺激组CBMC培养上清液中IL6水平与细胞凋亡率进行了相关分析，结果显示IL6产生水平与CBMC凋亡率呈显著负相关（r=-0.75,P<0.05）。

　　3  讨论

　　凋亡是细胞生理性死亡的主要形式，细胞增殖和凋亡的动态平衡是维持机体自身稳定的必要条件。业已研究证实，新生儿期T淋巴细胞存在凋亡过多现象，尤其以早产儿更为突出，此与其生理性T淋巴细胞功能低下密切相关，其凋亡程度与T淋巴细胞免疫表型不成熟、活化后分泌多种细胞因子水平均低下、蛋白激酶A活性升高和（或）蛋白激酶C不足或转位异常引起的细胞内信号传导不平衡等因素有关［3，4，8~11］。

　　黄芪为一种传统的扶正中药。据国内外研究证实，黄芪含黄芪皂甙、黄芪多糖（APS）、纤维素、黄酮及其衍生物、21种氨基酸和多种微量元素，具有广泛的药理作用。APS具有明显的免疫活性，对机体特异性与非特异性免疫功能都有广泛的影响。动物和人体外试验表明，AM可以增强吞噬细胞的吞噬功能，增强NK细胞数量及活性，并可增强T淋巴细胞增殖和活性，促进T淋巴细胞转化，提高IL2、IL2R、IL6和TNFα水平；临床观察显示，AM可显著降低慢性肾炎病人血清IL6和IL8水平，促进反复呼吸道感染和哮喘病儿PBCM体外产生IFNγ及IgG1、IgG2、IgG3水平，显著上调Th1细胞功能，也能促进Th2细胞的部分功能［5,6］。

　　迄今，尚无有关黄芪对淋巴细胞凋亡影响的资料报道。本研究显示，CBMC体外经PHA+AM刺激培养后细胞凋亡率显著低于单独PHA刺激组，表明黄芪能明显降低CBMC中淋巴细胞凋亡率。凋亡作为最基本的细胞生理过程，受到细胞内外多种因素的正负调节，包括凋亡基因、细胞因子、细胞间接触和细胞内信号传递等。新生儿T淋巴细胞免疫表型类似于Ⅲ期胸腺细胞，部分T淋巴细胞为CD+4与CD+8双阳性细胞，活化后所分泌的多种细胞因子水平均低下，细胞表面表达CD40L水平亦不足，此可能为其易于凋亡的重要原因之一。刘恩梅等［3，10］研究显示，脐血淋巴细胞凋亡为bcl2非依赖性，其细胞内信号传递不平衡可能是抗CD3单抗诱导脐血淋巴细胞凋亡的主要原因，而脐血淋巴细胞自发凋亡可能与蛋白激酶A活性升高有关。MCCONKEY等［11］研究显示，抗CD3诱导的人或鼠胸腺细胞凋亡伴有Ca2+升高，可通过蛋白激酶A激活蛋白激酶C纠正其凋亡，推测抗CD3刺激后细胞内Ca2+升高与蛋白激酶C不足或转位异常引起的细胞内信号传导不平衡是胸腺细胞发生凋亡的原因。另有研究报道，IGF1可促进未受抗原刺激的CD45RA+T淋巴细胞转化为成熟的CD45RO+记忆T淋巴细胞，抑制新生儿单个核细胞自发凋亡和PHA活化后的CD45RA+和CD45RO+T淋巴细胞凋亡，抑制PHA诱导的T淋巴细胞表达自杀基因Fas，提示IGF1具有促进脐血T淋巴细胞成熟、维持其生存，并通过下调Fas表达抑制脐血T淋巴细胞凋亡的作用［12］。

　　黄芪影响脐血T淋巴细胞凋亡的机制可能涉及多个方面。据文献报道，足月新生儿和早产儿CBMC中T淋巴细胞凋亡率与CD38阳性细胞表达率皆呈显著正相关，而与CD25阳性细胞表达率皆呈显著负相关［4］。本研究结果显示，CBMC体外经PHA+AM刺激培养后CD38阳性细胞表达率显著低于单纯PHA刺激组，而CD25阳性细胞表达率显著高于单纯PHA刺激组。上述结果表明，黄芪明显降低CBMC中T淋巴细胞凋亡率可能与促进胸腺细胞向成熟T淋巴细胞分化和促进T淋巴细胞活化有关。已有研究证实，CBMC体外培养时加入IL2或IL6能纠正T淋巴细胞的凋亡过度［3,9］。早产儿CBMC中T淋巴细胞的凋亡过度与IL6的产生不足呈显著负相关［4］。本实验显示，CBMC体外经PHA+IL6刺激培养后，其淋巴细胞凋亡率显著低于单纯PHA刺激组，而与PHA+AM刺激组比较无明显差异。本研究同时显示，PHA+AM刺激组和单纯PHA刺激组CBMC中T淋巴细胞凋亡率与培养上清液中IL6水平皆呈显著负相关，PHA+AM刺激组培养上清液中IL6水平较单纯PHA刺激组显著增高。结合我们先前的研究证实黄芪能促进CBMC分泌IL2，推测黄芪促进CBMC分泌IL2、IL6等多种细胞因子也可能是其阻抑CBMC凋亡的重要机制之一。

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　　（本文编辑  厉建强）

　　（青岛大学医学院附属医院儿内科，山东 青岛  266003；淄博市临淄区妇幼保健院儿科）