γ干扰素对骨吸收及实体瘤骨转移的体外抑制作用

　　［摘要］  目的  探讨体外实验中γ干扰素（IFNγ）对其他细胞因子引起的骨吸收及实体瘤骨转移病人外周血单个核细胞培养上清（PBMCs）促进的骨吸收的抑制作用。方法  利用新生鼠头顶骨进行体外骨吸收实验，分别验证细胞因子白细胞介素1（IL1）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、IFNγ、粒巨噬细胞生长因子（GMCSF）在体外对骨吸收的影响。检测8例实体瘤骨转移阴性及11例骨转移阳性病人PBMCs的骨吸收活性（BRA）。结果  IL1、IL6、TNF、GMCSF均可促进体外骨吸收，以IL1作用最强。而上述因子联合培养，BRA明显增强。IFNγ本身对骨吸收作用不明显，但能使IL1及细胞因子联合培养引起的骨吸收减弱。IFNγ可使实体瘤骨转移阳性病人PBMCs诱发的BRA增强明显降低(t=2.34,P<0.05)。结论  IL1、IL6、TNF、GMCSF在体外对骨吸收有促进作用；IFNγ在体外可使部分细胞因子及实体瘤骨转移阳性病人PBMCs促进的骨吸收作用减弱，提示γ干扰素可能存在抑制肿瘤转移作用。

　　［关键词］  干扰素γ；肿瘤转移；骨吸收

　　INHIBITORY EFFECT OF INFγ ON BONE RESORPTION AND BONE METASTASIS OF SOLID TUMOR IN VITRO

　　ZHANG MINGYONG, WANG HONGMEI，SUN WENXIN,  et al

　　(Department of Respiratory Diseases, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071,China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the inhibitory effect of IFNγ on bone resorption stimulated by cytokines and peripheral blood mononuclear cells cultural supernatant (PBMCs) of solid tumor patients with bone metastasis.MethodsBone resorption test was carried out using neonatal mouse calvaria to investigate the bone resorbing activity (BRA) of cytokines (IL1, IL6, TNF, GMCSF, and IFNγ). The BRA of PBMCs of 19 cases of solid tumor patients with or without bone metastasis and its interaction with IFNγ were tested.ResultsIL1,IL6,TNF, and GMGSF could stimulate bone resorption, and IL1 was the most potent stimulator, but when these cytokines were cocultured, the BRA was significantly strengthened. IFNγ itself had no evident effect on bone resorption, but it could ameliorate bone resorption induced by other cytokines. IFNγ could inhibit the BRA induced by PBMCs of solid tumor patients with multiple bone metastasis significantly, as compared with the control group without IFNγ(t=2.34,P<0.05).Conclusion IFNγ could reduce the BRA strengthened by some cytokines and PBMCs of patients with bone metastasis of solid tumors, which suggests that IFNγ may inhibit bone metastasis in solid tumors.

　　［KEY WORDS］IFNγ; neoplasms metastasis; bone resorption
   
　　在正常生理条件下，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的新骨形成达到平衡是维持骨完整性的必要条件。实体瘤骨转移产生骨损害是这一过程失衡后出现的常见疾病之一。实体瘤如乳癌、肺癌、前列腺癌等骨转移多见，它可以引起疼痛、高钙血症、病性骨折、骨髓侵犯、脊髓压迫等症状，导致病人生存质量下降及病死率增高。近年来许多实验证明，细胞因子与破骨细胞的骨吸收过程关系密切。既往曾通过体外实验验证了部分细胞因子及实体瘤转移病人外周血单个核细胞培养上清（PBMCs）对骨吸收活性（BRA）的影响，初步探讨实体瘤骨破坏的产生机制［1~3］。本实验拟进一步证实γ干扰素（IFNγ）对其抑制作用，旨在为实体瘤骨转移的生物治疗提供有益的参考数据。

　　1  材料和方法

　　1．1  材料

　　1．1．1  研究对象  实验动物:新生1~2 d龄昆明鼠50只。临床病理证实恶性肿瘤Ⅳ期病人19例，男6例，女13例，年龄35~85岁。肺癌13例，乳癌6例。其中无骨转移病人8例，包括肺腺癌4例，小细胞肺癌2例，乳癌2例。经核素骨扫描提示多发骨转移（≥3处）病人11例，包括肺腺癌7例，乳癌4例。收集病人PBMCs。

　　1．1．2  主要试剂及设备  rhIL1,rhIL6,rhTNFα,粒巨噬细胞生长因子(GMCSF),IFNγ,钙剂，液相闪烁液，超净台，液闪仪。

　　1．2  方法

　　1．2．1  PBMCs制备  取受试者空腹血5 mL置于肝素抗凝的无菌试管内，在超净台内分离白细胞层，稀释成2×109/L的单个核细胞悬液，按比例加入PHA，在CO2恒温培养箱孵育24 h，离心收获上清，-20 ℃保存待测。

　　1．2．2  骨吸收实验  参考Yamamoto的方法，略作改进。选1~2 d龄新生昆明鼠，腹腔内注射2 μL CaCl2溶液，间隔48 h后处死小鼠分离头顶骨，用IMDM培养液预培养24 h去除游离的45Ca。再将小鼠顶骨移至含FCS的IMDM培养液中，内含实验样本培养液。在37 ℃体积分数为0.05的CO2条件下培养72 h，分别收集顶骨和培养液，顶骨干燥后用甲酸液溶解。用β液闪程序分别测定培养液和溶解后顶骨cpm值，测定每孔样本45Ca释放率。

　　每孔样本45Ca释放率=培养上清测得值[]培养上清+溶解骨测得值×100%

　　BRA用被检标本与阴性培养液对照的45Ca释放百分率的比率表示。每份被检标本采用了2个顶骨检测，取其均值以增加准确性。

　　2  结果

　　2．1  部分细胞因子的骨吸收促进作用

　　IL1在105 U/L时体外BRA值为1.95±0.21,高于同浓度IL6及TNF诱发的BRA。并且，随着IL1浓度的增加，BRA增强。单用GMCSF时BRA亦增高，加入0.1 mg/L时BRA为1.79±0.67，加入1.0 mg/L时BRA为2.90±0.68。将IL1、IL6、TNF各105 U/L联合培养，BRA进一步增强，高达4.89±0.76，而再加入1.0 mg/L GMCSF时，BRA增高更加明显，达到5.11±0.67。见表1。

　　2.2  干扰素对骨吸收的抑制作用

　　应用IFNγ与IL1以及IL1、IL6、TNF混合物联合培养，结果显示，0.3、3.0 U/L IFNγ均可使IL1引起增高的BRA降低，3.0 U/L IFNγ可使细胞因子联合培养促进的BRA由3.88±0.29降到2.40±0.27。见表2。

　　2.3  IFNγ对实体瘤骨转移病人PBMCs BRA的抑制作用

　　11例实体瘤多发骨转移病人及8例骨转移阴性病人PBMCs的BRA值分别为4.12±1.85、2.35±0.90，两组相比差异有显著性(t′=2.76,P<0.05）。骨转移阳性病人PBMCs中加入3.0 U/L IFNγ后BRA降至2.80±1.10，差异有显著性（t=2.34,P<0.05）。

　　表1  各种细胞因子及其联合培养的体外BRA(略)

　　注：GMCSF质量浓度为1.0 mg/L

　　表2  IFNγ对细胞因子诱发BRA的抑制作用(略)

　　注：GMCSF的浓度为1.0 mg/L

　　3  讨论

　　本实验结果再次证明，IL1、IL6、TNF的体外骨吸收促进作用。其中IL1作用最强，分别为同浓度IL6和TNF的1.45倍及1.24倍。这些细胞因子均可来源于单核、巨噬细胞和成骨细胞，具有多种生物学功能。IL1作用于骨，主要是影响骨细胞复制、调节黏附分子在肿瘤细胞和内皮的表达，因此肿瘤细胞可通过其介导激活破骨细胞，促进溶骨［4］。随IL1剂量的增强，其促进的骨吸收活性增加。IL6是一种自分泌生长因子，其作用广泛，功能也比较复杂。有文献报道,IL6本身在体外不能刺激骨吸收，需要与可溶性IL6受体结合才能表现诱导破骨细胞形成的能力［3］。本实验证实了IL6较弱的促体外骨吸收活性作用。TNF最初发现对肿瘤细胞有细胞毒和细胞抑制作用，最近许多实验证明其对正常细胞的生长和功能有调节作用，特别是促使破骨细胞活性增加，引起骨的吸收，本实验也证实这一点。本实验中，我们应用IL1、IL6、TNF各105 U/L联合培养，结果BRA增加到各因子单独作用的2.5~3.5倍，这表示三者之间有明显的协同作用，使骨吸收增强。另外，GMCSF对骨吸收的作用尚有争议。GMCSF是一种明确的造血细胞生长因子，但能够刺激非造血的肿瘤细胞的生长，具有形成骨转移的潜能。它可能成为破骨细胞前体细胞增殖分化促进因子，对于破骨细胞的成熟有重要作用［5］。本实验显示，加用GMCSF可增强其他细胞因子联合培养促进的骨吸收活性。在IL1、IL6、TNF联合培养中，加入GMCSF后BRA由4.89±0.76增至5.11±0.67。结果提示在体外实验中，GMCSF与其他因子骨吸收有协同作用。

　　干扰素是由活性淋巴细胞和成纤维细胞等产生的一种糖蛋白，具有抗病毒和抗细胞增殖功能。本实验结果显示，0.3、3.0 U/L的IFNγ均可降低由IL1诱发的BRA增高，而对TNF诱发的骨吸收作用不大。在加用GMCSF联合培养的骨吸收实验中，IFNγ作用尤为明显，BRA由3.88±0.29降至2.40±0.27。本实验在体外证实了IFNγ可抑制由部分细胞因子介导的骨吸收。其机制可能与干扰素通过抑制早期破骨细胞前体的增殖，部分地减少破骨细胞的形成，同时还与其能刺激成骨细胞介导的骨形成以抑制骨吸收有关［4,5］。

　　我们利用骨吸收实验，检测了8例骨转移阴性及11例骨转移阳性实体瘤病人外周血PBMCs骨吸收活性，以及IFNγ对骨转移阳性病人PBMCs骨吸收活性的抑制作用。结果表明，实体瘤多发性骨转移病人PBMCs的BRA明显高于相应肿瘤无骨转移者，而IFNγ可明显降低实体瘤多发性骨转移者PBMCs的BRA。骨转移阳性病人外周血存在促进骨吸收的因子，这些因子可能也是促进肿瘤发生骨转移的因素之一。由于没有做单抗阻滞实验，我们无法确定这些骨吸收促进因子的类型。IFNγ可能减弱骨转移促进因子的作用，成为抑制性因子。这为今后骨转移机制的探讨提供了有益借鉴。实验选择乳癌、肺腺癌等临床有多处明确溶骨病变的病人，而对于其他类型骨转移病人外周血体外骨吸收作用仍待研究。

　　总之，细胞因子在骨吸收及实体瘤骨转移的发生、发展过程中起重要作用。对它们致病生物特性的阻断及利用IFNγ对肿瘤进展的抑制，可能会成为辅助常规化疗的有效生物治疗措施。相信对肿瘤骨转移机制的深入研究及新型药物的开发，必将为肿瘤的姑息及生物治疗开辟广阔前景。

　　［参考文献］

　　［1］RUBEN R D, COLEMAN R E. Bone metastases［M］// ABELOFF M D, ARNITAGE J O. Clinical Oncology． England： Churchill Livingstone, 1995: 643645.

　　［2］VINHOLES J, COLEMAN R, EASTELL R. Effect of bone metastasis on bone metabolism implications for diagnosis,imaging and assessment of response to cancer treatment［J］. Cancer Trent Rev, 1996,22:289.

　　［3］王红梅,纪霞,于君.细胞因子与骨吸收及肺癌骨转移相关性研究［J］.山东医药,2001,41(3):1.

　　［4］ ORR F W, SANCHEZSWEATMAN H, KOSTENUIK P, et al. Tumorbone interactions in skeletal matastasis［J］. Clin Orthop Rela Res,1995,312:19.

　　［5］MORINAGE Y, FUJITA N, OHISHI K,et al. Stimulation of interleukin11 production from osteoblastlike cells by transforming growth factorβ and tumour cell factor［J］. Int J Cancer,1997,71:422.

　　（本文编辑  马伟平）

　　（青岛市市立医院呼吸内科，山东 青岛  266071）