EB病毒相关胃癌组织中P53及P21蛋白的表达

　　［摘要］  目的  探讨EpsteinBarr病毒（EBV）感染、P53和P21蛋白表达异常在胃癌发生发展中的作用以及三者相关性。方法  应用免疫组化技术检测13例EBV相关胃癌（EBVaGCs）、45例临床指标与之匹配的EBV阴性胃癌（EBVnGCs）以及58例相应癌旁组织中P53和P21蛋白的表达。结果  胃癌组织P53蛋白阳性率明显高于癌旁组织，差异有极显著性（χ2=50.000，P＜0.01）。EBVnGCs组织中P53蛋白阳性率与EBVaGCs相比差异无显著性（χ2=0.072,P＞0.05）;但EBVaGCs组织P53蛋白过表达率明显低于EBVnGCs组织，差异有极显著性（χ2=7.259,P＜0.01）。胃癌组织P21蛋白阳性率明显低于癌旁组织，差异有极显著性（χ2=12.500，P＜0.01）。EBVnGCs与EBVaGCs组织P21蛋白阳性率无明显差异（P＞0.05）。胃癌组织中P21与P53蛋白共同表达率较高,但无显著相关性(χ2=1.323，P＞0.05，r=0.202 5)。结论  P21蛋白表达存在p53依赖性和p53非依赖性两条途径；胃癌组织中EBV感染与P53蛋白的异常表达有关，而与P21蛋白异常表达无显著相关性。

　　［关键词］  胃肿瘤；疱疹病毒4型，人；基因，p53；基因，p21;免疫组织化学

　　THE EXPRESSION OF P53 AND P21 PROTEIN IN EPSTEINBARR VIRUSASSOCIATED GASTRIC CARCINOMA

　　SUN YINGJUAN, SUN JIANPING, HUANG BAOHUA, et al

　　(Department of Nosocomial Infection Management, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo understand the role of abnormal expression of P53 and P21 protein in oncogenesis and development of EBVaGCs and to analyze the relationship between EBV infection and P53 and P21 expression. MethodsP53 and P21 protein expressions were tested by immunohistochemistry in 13 EBVaGCs and 45 EBVnGCs with matched clinicopathological parameters and 58 corresponding adjacent tissues of gastric carcinoma. ResultsP53 immunoreactivity was significantly higher in gastric carcinomas than in corresponding adjacent normal tissues (χ2=50.000，P＜0.01). The expression of P53 protein in EBVnGCs was not significantly different from that in EBVaGC （χ2=0.072, P＞0.05）. The overexpression of P53 protein in EBVaGCs was significantly lower than in EBVnGCs (χ2=7.259, P＜0.01). P21 immunoreactivity was significantly lower in gastric carcinomas than in corresponding adjacent normal tissues (χ2=12.500，P＜0.01). The expression of P21 in EBVaGCs and EBVnGCs was similar (P＞0.05). There was no significant correlation between P21 and P53 expression (χ2=1.323，P＞0.05，r=0.202 5). ConclusionThe expression of P21 protein is induced by both p53dependent and p53independent pathways. The infection of EBV in gastric carcinoma tissues is related with the abnormal expression of p53 . But there is no relation between the infection of EBV and the abnormal expression of p21 in gastric carcinoma tissues.

　　［KEY WORDS］stomach neoplasms; herpesvirus 4,huaman; genes, p53;  genes, p21; immunohistochemistry
   
　　EpsteinBarr病毒（EBV）属疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员，广泛分布于世界各地，为95%以上的健康成人所携带，与人类多种肿瘤密切相关。自1990年BURKE等［1］首先报道EBV感染与胃癌相关以来，国内外学者采用多种检测技术相继在各种类型的胃癌组织中检测到EBV，EBV与胃癌的相关性得以证实，EB病毒相关胃癌（EBVaGCs）在世界范围内普遍存在［2］，但EBV在EBVaGCs发病机制中的确切作用尚未明了。

　　本研究选择EBVaGCs和临床病理资料与之匹配的EBV阴性胃癌（EBVnGCs）作为研究对象，应用免疫组化技术检测胃癌和相应癌旁组织中P53和P21蛋白的表达，以探讨EBVaGCs发生发展与P53和P21蛋白表达异常的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象

　　选取13例EBVaGCs和45例临床病理资料与之匹配的EBVnGCs作为研究对象，病人平均年龄（57.88±13.35）岁（31~81岁），其中男性48例，女性10例。全部病例均经病理诊断证实。两组病人在年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、有无淋巴结转移以及临床分期等方面均无显著性差异（P>0.05）。

　　1.2  P53和P21蛋白表达的免疫组化检测

　　采用免疫组化抗原热修复技术检测P53和P21蛋白表达，抗原修复液为枸橼酸缓冲液（pH 6.0），一抗分别为1∶100稀释的鼠抗人p53单克隆抗体Do7和鼠抗人p21单克隆抗体F5（均为Santa Cruz Biotechnology Inc产品）。分别用已知P53阳性的胃癌组织标本和P21阳性的乳癌组织标本作阳性对照；PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3  免疫组化结果判断

　　P53和P21免疫组化染色阳性信号均呈棕黄色，严格定位于细胞核。参照文献［3］确定P53蛋白染色结果判断标准,选取切片中阳性表达最强的10个视野，根据阳性细胞数量的多少分成5级。(-)：阳性细胞数0；(+)：阳性细胞数1%~25%；()：阳性细胞数26%~50%；()：阳性细胞数51%~75%；()：阳性细胞数76%~100%。根据阳性细胞核的着色深浅及均匀度，分成2度：Ⅰ度表现为阳性细胞核染色不均匀，深浅不等；Ⅱ度为阳性细胞核着色强而均匀。将P53过表达定为阳性分级()~()，阳性度Ⅱ度。

　　P21阳性信号呈棕黄色，根据阳性细胞数量的多少，分成4级。(-)：阳性细胞数0～5%；(+)：阳性细胞数6%～20%；()：阳性细胞数21%～50%；()：阳性细胞数50%以上。

　　1.4  统计学分析

　　数据间比较采用四格表χ2检验，用SAS 6.12统计软件处理。

　　2  结果

　　2.1  胃癌及相应癌旁组织中P53和P21蛋白表达

　　胃癌组织中P53和P21蛋白阳性率分别为86.21%（50/58）和62.07%（36/58），P53蛋白过表达率为48.27%（28/58）；癌旁组织P53蛋白染色均为阴性，而P21蛋白阳性率为89.66%（52/58）。胃癌组织P53蛋白的阳性率明显高于癌旁组织，差异有极显著性（χ2=50.000，P＜0.01）；而胃癌组织P21蛋白的阳性率明显低于癌旁组织，差异有极显著性（χ2=12.500，P＜0.01）。胃癌组织中存在P53和P21蛋白异常表达，比较P53阳性组和阴性组以及P21阳性组和阴性组病人各临床病理指标，结果显示虽然有些指标间存在一定差异，但这些差异均无统计学意义（P>0.05）。

　　2.2  EBVnGCs和EBVaGCs组织中P53蛋白表达

　　EBVnGCs组织中P53蛋白阳性率为86.67%（39/45），而P53蛋白过表达率为57.78%（26/45）；EBVaGCs组织中P53蛋白阳性率为84.62%（11/13），P53蛋白过表达率为15.38%（2/13）。两组间P53蛋白阳性率无明显差异（χ2=0.072,P＞0.05），但EBVaGCs组织中P53蛋白的过表达率明显低于EBVnGCs组织，差异有极显著性（χ2=7.259,P＜0.01）。

　　2.3  EBVnGCs和EBVaGCs组织中P21蛋白表达

　　EBVnGCs组织中P21蛋白阳性率为57.78%（26/45），EBVaGCs组织中P21蛋白的阳性率为76.92%（10/13）。与EBVnGCs组织相比较，虽然EBVaGCs组织P21蛋白阳性率有增高趋势，但差异无显著性（χ2=0.862,P＞0.05）。

　　2.4  胃癌组织中P53与P21蛋白表达相关性分析

　　58例胃癌组织中，P53（+）P21（+）者33例，占56.9%；P53（-）P21（-）者5例，占8.6%；而P53（+）P21（-）者17例，P53（-）P21（+）者3例，共占34.5%。虽然P21与P53蛋白共同表达率较高,但二者无显著相关性（χ2=1.323，P＞0.05，r=0.202 5）。

　　3  讨论

　　世界范围的研究表明，2%～16%的胃癌与EBV感染有关，与EBVnGCs相比，EBVaGCs具有独特的蛋白表达模式及临床病理学特征［4，5］。EBV可通过调节参与细胞周期调控的重要RNA分子而直接影响EBVaGCs的发病机制［2］。

　　p53基因是非常重要的抑癌基因，p53基因异常与胃癌的发生发展密切相关。本研究结果表明，胃癌组织P53蛋白阳性率明显高于癌旁组织，虽然EBVaGCs组织和EBVnGCs组织P53蛋白阳性率无显著性差异，但EBVaGCs组织P53蛋白过表达率明显低于EBVnGCs组织，与ISHII等［6］研究结果相似。表明EBV感染和p53基因异常与胃癌发生有关，EBVaGCs组织中存在P53蛋白异常累积，EBV感染在胃癌发生过程中不能取代p53基因异常，也不能排除在肿瘤发生过程中突变型P53蛋白与EBV感染共同作用的可能性。王云等［7］对EBV相关胃癌组织中EBV编码基因与P53蛋白表达的关系进行了研究，结果表明，EBV编码蛋白干扰了p53基因功能，EBVaGCs组织中P53蛋白微弱～中等程度的表达与EBNA1Gar区、BZLF1与野生型P53蛋白的结合有关,两者共同作用使P53蛋白积累,增强其抑制肿瘤细胞生长的能力,这或许可作为EBVaGCs预后较好的合理解释之一。

　　抑癌基因p21异常与多种恶性肿瘤的发生有关。研究证实，胃癌组织中无p21基因突变，胃癌细胞系p21 mRNA呈低表达或表达缺失，伴随胃癌的进展P21蛋白表达缺失上升，p21基因可能通过其编码蛋白的表达来调节细胞周期，从而参与肿瘤的发生和发展［8～10］。本研究的免疫组化检测结果表明，胃癌组织P21蛋白的阳性率明显低于癌旁组织，胃癌组织中存在P21蛋白低表达率，支持上述观点。p21基因为p53基因的下游调控基因，P21蛋白的阳性表达一般作为p53基因活性保持的标志。本文研究结果显示，EBVaGCs组织P53蛋白过表达率明显低于EBVnGCs组织，差异有极显著性，推测EBVaGCs中野生型P53蛋白被有效保护下来。但EBV编码蛋白（如BZLF1等）对p53的转录激活功能又有干扰作用，导致p53下游靶基因（如p21和mdm2等）的表达受阻［11］。与EBVnGCs组织相比，EBVaGCs组织P21蛋白阳性检出率有增高趋势，但两组间差异无显著性。由于基因调控的复杂性，P21蛋白表达存在p53依赖性途径和p53非依赖性途径的激活，可能造成P21蛋白表达的复杂多样性。XIE等［10］研究结果表明，在正常胃黏膜和良性增生性胃黏膜组织中P21蛋白表达主要通过p53依赖性途径，而在胃癌组织中则未见明显相关性。本研究结果证实了上述观点。

　　综上所述，EBV感染、P53和P21蛋白表达异常与胃癌发生有关，胃癌组织中P21蛋白表达存在p53依赖性和p53非依赖性两条途径。胃癌组织中EBV感染与P53蛋白的异常表达有关，而与P21蛋白的异常表达无显著相关性。

　　［参考文献］

　　［1］BURKE A P, YEN T S, SHEKITKA K M, et al. Lymphoepithelial carcinoma of the stomach with EpsteinBarr virus demonstrated by polymerase chain reaction［J］. Mod Pathol，1990,3:377.

　　［2］IWAKIRI D, EIZURU Y, TOKUNAGA, et al. Autocrine growth of EpsteinBarr viruspositive gastric carcinoma cells mediated by an EpsteinBarr virusencoded small RNA［J］.Cancer Res，2003，63(21):7062.

　　［3］LEUNG S Y, CHAU K Y, YUEN S T, et al. p53 overexpression is different in EpsteinBarr virusassociated and  EpsteinBarr virusnegative carcinoma［J］. Histopathology， 1998,33(4):311.

　　［4］ZUR HAUSEN A, VAN REES B P, VAN BEEK J, et al. EpsteinBarr virus in gastric carcinomas and gastric stump carcinomas:a late event in gastric carcinogenesis［J］. J Clin Pathol,2004,57(5):487.

　　［5］阎丽平，罗兵，王笑峰，等.EBV相关胃癌组织中bcl2和ki67蛋白表达的检测［J］.青岛大学医学院学报，2004，40（1）：57.

　　［6］ISHII H, GOBE G, KAWAKUBO Y, et al. Interrelationship between EpsteinBarr virus infection in gastric carcinomas and the expression of apoptosisassociated proteins［J］. Histopathology, 2001，38: 111.

　　［7］王云，罗兵，黄葆华，等.EB病毒相关胃癌中EB病毒编码基因与P53蛋白的表达［J］.中华消化杂志，2004，24（6）：366.

　　［8］  NODA H, MAEHARA Y, IRIE K, et al. Growth pattern and expressions of cell cycle regulator protein P53 and p21WAF2/CIP1 in early gastric carcinoma［J］.Cancer，2001,92(7):1828.

　　［9］ SEO Y H, JOO Y E, CHOI S K, et al. Prognostic significance of p21 and p53 expression in gastric cancer［J］. Korean J Intern Med，2003，18(2):98.

　　［10］XIE H L, SU Q, HE X S, et al. Expression of p21(WAF1) and p53 and polymorphism of p21(WAF1) gene in gastric carcinoma［J］. World J Gastroenterol，2004，10(8):1125.

　　［11］MAUSER A, SAITO S, APPELLA E, et al. The EpsteinBar virus immediateearly protein BZLF1 regulates p53 function through multiple mechanism［J］. J Virol,2002,76(24):12503.

　　（本文编辑  黄建乡）

　　（青岛大学医学院附属医院感染管理科，山东 青岛  266003；青岛大学医学院微生物学教研室；青岛大学医学院附属医院病理科；烟台毓璜顶医院病理科）