BCG对Th细胞免疫调节作用的研究

    ［摘要］  目的  探讨BCG对小鼠Th1/Th2细胞免疫反应的调节作用，研究BCG是否增强小鼠Th1型免疫反应。方法  将实验动物分为对照Ⅰ组、BCG14组、对照Ⅱ组、BCG42组。BCG14组、BCG42组给予BCG每次0.03 mL, 隔日1次腹部皮下注射，对照组注射相同剂量的生理盐水。第14天，将对照Ⅰ组、BCG14组分别处死取脾脏，BCG42组则继续行BCG免疫，至第42天对照Ⅱ组及BCG42组处死取脾脏。用ELISA法测定脾脏单个核细胞（MNCs）培养上清液中IL4、IL5、IFNγ含量。结果  BCG14组、BCG42组IFNγ水平较对照组明显增加(t=3.73、3.86,P<0.01)。BCG14组IFNγ水平与BCG42组比较差异无显著性意义（t=1.68, P>0.05）。其他两项指标与对照组比较差异无显著性（t=1.05～1.17, P>0.05）。结论  BCG能上调小鼠Th1型免疫反应。

　　［关键词］  BCG；白细胞介素4；白细胞介素5；干扰素Ⅱ型；小鼠，近交BALB C

　　EFFECTS OF BCG ON THE REGULATION OF Th CELL IMMUNITY

　　LIU WEI,  GUO LING,  MIAO WENYU,  et al

　　(Department of Respiratory Diseases,  Rizhao Peoples Hospital,  Rizhao 276826, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of BCG on the regulation of Th1/Th2 balance in mice and explore whether BCG increased  type Th1 immune response.  MethodsThe experimental animals were divided into Control Group Ⅰ and BCG14 Group; Control Group Ⅱ and BCG42 Group. For BCG14 Group and BCG42 Group,   a dose of BCG 0.03 mL was injected subcutaneously every other day and normal saline,  same dose,  for control groups. On day 14,  those in Control Group Ⅰ and BCG14 Group were killed and spleens removed; those in BCG42 Group continued BCG immunity and killed on day 42,  and the spleens removed. The levels of interleukin4,  interleukin5 and interferonγ of mononuclear cells (MNCs) supernatant were measured by ELISA.   Results IFNγ levels in BCG14 and BCG42 groups were significantly higher than those in the control group (t=3.73, 3.86;P<0.01). The difference of IFNγ levels of MNCs supernatant between BCG14 and BCG42 was not significant (t=1.68,   P>0.05). As compared with control groups,  the difference of the other two items showed no significance （t=1.05-1.17, P>0.05）.ConclusionBCG immunization could upregulate Th1type immune response.

　　［KEY WORDS］BCG;interleukin4;interleukin5;interferon typeⅡ; mice,  inbred BALB C
   
　　活化的CD4+辅助细胞按功能和分泌的细胞因子的不同至少分为Th1、Th2。Th1细胞主要分泌白细胞介素2、γ干扰素（IFNγ），诱发巨噬细胞（Mφ）活化和迟发超敏反应。Th2细胞主要分泌白细胞介素4（IL4）、白细胞介素5（IL5）等，诱发肥大细胞与Eos生长分化和包括IgE在内的免疫球蛋白生成；其中，IFNγ、IL4分别是Th1和Th2细胞的特征性细胞因子，Th1和Th2细胞因子可促进本亚群、抑制另一亚群的生长分化。流行病学研究表明，病毒或细菌感染的频率和强度与变应性疾病的发展和流行呈反比［1～3］，原因为Th1型及Th2型T细胞的各自的细胞因子有相互抑制分化的作用。分支杆菌是最有力的Th1型免疫反应诱导者［4～6］，其中BCG作为结核分支杆菌的减毒活疫苗，具有很强的非特异性免疫刺激作用，BCG诱导的机体免疫反应是一种典型的Th1型反应，Th1型细胞产生IFNγ和白细胞介素2细胞因子，调节细胞因子的活动性和延迟型超敏反应［7，8］。本研究旨在对BCG的作用机制进一步探讨。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物和分组

　　28只6周龄未用BCG免疫的雌性BALB C小鼠，每7只一组分装在不同的笼子里，分为对照Ⅰ组，BCG14组，对照Ⅱ组，BCG42组，鼠病毒抗体滴度均为阴性。实验期间以不含OVA的食物及水饲养动物。

　　1.2  动物处理

　　对照Ⅰ组：实验第1天始，隔日腹部皮下注射生理盐水0.03 mL，第14天处死小鼠取脾脏。BCG14组：自实验第1天始，隔日腹部皮下注射1次BCG, 每次0.03 mL, 第14天处死小鼠取脾脏。对照Ⅱ组：自实验第1天始，隔日腹部皮下注射生理盐水0.03 mL，第42天处死小鼠取脾脏。BCG42组：自实验第1天始，隔日腹部皮下注射BCG 1次, 每次0.03 mL，第42天处死小鼠取脾脏。

　　1.3  组织培养和单个核细胞致敏

　　无菌条件下将脾脏组织块放入平皿，生理盐水洗涤、剪碎，放入研磨器中，加入1～2 mL生理盐水，用研磨棒研成组织匀浆，加生理盐水20    mL，冲洗研磨器，收集细胞悬液，经400目尼龙网过滤后，以800 r/min离心5 min，再以生理盐水洗2次，离心沉淀。吸取淋巴细胞分层液5 mL置于15 mL离心管中，倾斜45°，将脾脏细胞悬液10 mL在距分层液界面以上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液液面。离心管置水平式离心机内，在18～20 ℃条件下，以2 000 r/min离心30 min，吸取脾脏单个核细胞（MNCs）层，弃上清液，将所得脾细胞悬液用5倍体积RPMI1640及体积分数0.10 Fcs液（Gibco公司）洗涤2次，依次以1 500 r/min、1 000 r/min在室温下离心10 min，去除混杂的血小板，用RPMI1640及体积分数0.10 Fcs液定容细胞，细胞在库尔特计算器中计数。调整细胞至每Well 2×106个, 在96Well U型组织培养盘中37 ℃条件下孵化1 h，然后加入50 mg/L的OVA培养96 h，取上清液于-80 ℃冻存备用。

　　1.4  细胞因子的测定

　　脾脏MNCs培养上清液中IL4、IL5和IFNγ含量用ELISA法测定［9］，ELISA试剂盒购自美国Endogen Inc公司。

　　1.5  统计学分析

　　结果以±s表示，统计处理采用t检验。

　　2  结果

　　BCG14组、BCG42组IFNγ水平较对照组明显增加(t=3.73、3.86,P<0.01)。BCG14组IFNγ水平与BCG42组比较差异无显著意义（t=1.68, P>0.05）。其他两项指标与对照组比较差异无显著性（t=1.05～1.17, P>0.05）。见表1。

　　表1  BCG免疫后各组MNCs培养液细胞因子含量比较（略）

　　3  讨论

　　BCG为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸, 具有很强的非特异性免疫刺激作用，其诱导的机体免疫反应是一种典型的Th1型免疫反应。研究证明, BCG是一种Th1型免疫反应的强有力的诱导剂，它可刺激产生IFNγ的Th1淋巴细胞的发育和Mφ的大量聚集、活化。实验证明BCG含有许多免疫刺激分子，如分支杆菌的细胞壁成分（mApG和相关的脂多糖），其分泌的蛋白质以及分支杆菌释放的DNA的非甲基化拷贝等，均可诱导产生Th1反应［10］。另外，BCG感染可诱导CD4+自然杀伤T细胞变成Th1细胞［11］，从而进一步放大Th1反应。

　　本文结果显示，BCG增强了BALB C小鼠的Th1型免疫反应。BCG能使BCG14组小鼠脾脏的MNCs培养液中IFNγ水平较对照Ⅰ组明显升高，也使BCG42组IFNγ水平较对照Ⅱ组明显升高。以上结果提示，BCG能上调小鼠Th1型免疫反应。

　　BCG通过产生IFNγ而抑制肺局部Th2反应，BCG不能抑制IFNγ受体缺陷鼠的气道特应性炎症。IFNγ通过上调MHC抗原、B7免疫共刺激分子、ICAMs和凋亡结构（FASTNFα）等重要的细胞表面蛋白，激活Mφ，直接抑制Th2细胞的发育或促进树突状细胞的活化和抗原提呈等来抑制Th2反应。气道Th2免疫反应依赖于CD80、CD86分子提供的共刺激信号，IFNγ可能通过下调树突状细胞的CD80的表达来抑制Th2细胞的激活，但不影响抗原提呈给Th1细胞。此原因可能为暴露于结核杆菌感染的环境下，Mφ可以提呈抗原且这种提呈能力在接触IFNγ后得到加强［10～12］。

　　综上所述，BCG具有很强的非特异性免疫刺激作用，可诱导IFNγ的产生和增强Th1保护性免疫反应，从而抑制哮喘的发作。

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　　（本文编辑  厉建强）

　　［作者简介］刘伟（1968），女，硕士，主治医师。

　　（日照市人民医院呼吸科，山东 日照  276826；山东大学齐鲁医院；日照市开发区计划生育服务站）