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［摘要］目的 筛选并鉴定与表达人CD59的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞特异结合的内化短肽，为设计具有拮 抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽药物奠定基础。 方法 以高表达人CD59的CHO细胞为靶，对噬菌体随机十二肽库 进行5轮亲和筛选，并进行竞争结合实验，用ELISA法筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。 结果 随机挑选的10个克隆中有6个与人CD59结合力高，测序后得到2个高度同源的氨基酸序列。 结论 获得了与高 表达人CD59的CHO细胞结合的内化短肽序列，为进一步设计与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供 了参考依据。
［关键词］卵巢细胞;肽库;内化短肽;CD59蛋白;膜蛋白质类
SCREENING THE SHORT INTERNATION PEPTIDE COMBINED WITH CHO CD59 THROUGH PHAGE
CHENG YING，GAO MEI-HUA ， WANG BING， et al
（Department of Immunology， Qingdao University Medical College ，Qingdao 266021， China）
［ABSTRACT］Objective To search for a short internation peptide specifically combined with CHO cells for the purpose to establish a base of designing a peptide drug to inhibit CD59 on tumor sneaking through. Methods Taking CHO cells of high-ex- pressing CD59 as a target，a five-round affinity screening was done randomly for peptide library 12. After competitive test， positive phage clones were selected by ELISA and subsequently underwent DNA sequencing. Results Six out of 10 selected phage clones possessed the high affinity to CD59. After DNA sequencing， two pieces of short peptides highly homogeneous to CD59 were ob- tained. Conclusion This study might provide the reference for the design of a drug similar to the short peptide of CD59 on tumor sneaking through by obtaining the sequence of the internation peptide.
［KEY WORDS］ ovary cell; peptide library; internation peptide; CD59 protein; membrane proteins
肿瘤化疗因其严重的毒副作用限制了治疗效果的进一步提高，从而使免疫治疗广受关注，而免疫治疗中免疫逃逸的问题已成为影响其临床疗效的关键［1，2］。研究证实，在大多数实体瘤细胞膜表面存在CD59等一系列的膜补体调节蛋白，使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单抗治疗中由补体介导的溶细胞作用［3，4］。本研究利用噬菌体表达的随机十二肽库筛选与高表达人CD59中国仓鼠卵巢（CHO）细胞特异结合的内化短肽，以选择肿瘤靶 向治疗的载体，从而为体外合成更为高效和特异的阻断CD59肿瘤逃逸相关位点短肽药物奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料来源
噬菌体随机十二肽库试剂盒（包括随机十二肽库，受体菌ER2738以及测序引物5′-HOCCCT- CATAGTTAGCGTAACG-3′）购自New England BioLab公司。RPMI 1640培养基购自HyClone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。HRP标记的兔抗山羊IgG（H+L）为北京中 山生物技术有限公司产品。羊抗人CD59多克隆抗体为Sigma Aldrich公司产品。TritonX-100、IPTG/X-gal、PEG8000均购自华美公司。高表达人 CD59的CHO细胞株由本室提供。
1.2 高表达人CD59的CHO细胞筛选噬菌体肽库
在6孔培养板，将高表达人CD59的CHO细胞 培养至单层贴壁铺满板底，加入含1 g/L的BSA的 1640培养基于37 ℃孵育1 h。加入Ph. D. 12噬 菌体肽库的原液（滴度为2×1016pfu/L）37 ℃孵育1 h 。预冷的1 g/L PBST洗涤后，加入2 mL pH2.2 的甘氨酸缓冲液于冰上放置15 min，收集洗脱液后，每孔加入10 g/L的TritonX-100液2 mL于室温作用2 h以裂解细胞。计数，扩增，提纯噬菌体。5轮 筛选结束后，测定滴度并在IPTG/X-gal琼脂板上随机选择10个蓝色噬斑进行大量扩增提纯。
1.3 与野生型噬菌体M13的竞争结合实验
将第2、3、4、5轮筛选扩增后的噬菌体及随机挑选扩增后的 10 个噬菌体，分别与野生型 M13 噬菌 体以1∶1 的比例混合，加入到已长有转染人CD59 CHO细胞的12孔培养板中进行前述洗涤、筛选、裂解过程。
1.4 噬菌体阳性克隆的ELISA法鉴定
将前述的噬菌体克隆纯化，以滴度为1.0×1015pfu/ L纯化噬菌体（每孔50 μL）包被酶联板过夜。用1 g/L牛血清清蛋白（BSA）封闭后，每孔加入100 μL细胞膜裂解物［5］，37 ℃作用1 h，1∶400羊抗人CD59 Ab 37 ℃作用1 h，1∶5 000 HRP-兔抗羊抗体37 ℃作用1 h，以OPD底物显色后，测定490 nm处吸光度值，以噬菌体原库为阴性对照。
1.5 DNA序列测定
扩增并按NEB试剂盒说明书纯化阳性噬菌体克隆，抽提单链DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。使用NEB公司提供的测序引物送上海生工生物公 司全自动测序。
2 结 果
2.1 十二肽库筛选
在5轮筛选中，逐轮缩短与靶细胞的作用时间，筛选结果回收率逐轮提高，显示出较好的富集效果。见表1。表1 高表达人CD59的CHO细胞结合内化短肽的筛选（略）
2.2 与野生型M13噬菌体竞争结合实验结果
将10个随机挑选的单克隆和4轮筛选后的噬菌体库分别与野生型M13噬菌体进行竞争结合实验（10个随机挑选的单克隆结合力分别为23、26、 22、31、25、27、22、25、29、30倍），4轮筛选后的噬菌 体库的结合力逐渐增高（结合力分别为1、13、25、28倍），但第4、5轮之间差别不大。
2.3 噬菌体克隆与人CD59的结合
利用ELISA法对竞争结合实验后的10个噬菌体克隆进行鉴定，其中有6个克隆与CD59结合较强（吸光度>0.5，吸光度值分别为0.501、0.505、0.521 、0.511、0.519、0.507），噬菌体原库作为阴性对照（吸光度值为0.063）。
2.4 DNA测序及氨基酸序列的推导
提取6个阳性克隆的单链DNA进行序列分析，其中4个克隆所含DNA序列完全相同（HSAC-DLPMHPMC），另2个克隆氨基酸序列略有不同 （HSACDLLMHPMC），两种序列的疏水性氨基酸 数目均为6个。
2.5 推导的氨基酸序列与蛋白质数据库的比对
将上述3条序列提交蛋白质数据库（http:// pir.georgetown.edu/）进行比对，未发现有同源性一致的序列。由于在蛋白质相互作用过程中起重要 作用的可为几个关键性的氨基酸基序，因此我们将上述3条序列中每连续的6个氨基酸为一组的多肽序列与蛋白质数据库比对，获得的蛋白为酶、受体、 信号转导蛋白等。结果见表2。表2 短肽序列与蛋白质数据库比对后所得部分蛋白质（略）
3 讨 论
机体抗肿瘤的免疫效应与肿瘤逃避免疫系统的攻击之间形成一对此消彼长的矛盾关系。目前，在多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的过表达，并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。研究显示，卵巢癌细胞SKOV3和前列腺癌细胞PC3的 发生发展与CD59密切相关，细胞中过量表达的 CD59分子是导致子宫内膜癌发生、发展以及恶变的一个重要因素，而且直接导致癌细胞逃逸机体的免疫监视，从而促进癌细胞的生长及靶向单抗治疗中由补体介导的溶细胞作用［6］。本课题组的前一项 研究结果显示，CD59分子中N37～H44位点氨基酸与人类糖尿病血管增殖症的发生密切相关，其NMR结构也同样显示抗补体活性区域也主要集中于N37～H44之间［7］ 。肿瘤逃逸相关活性位点是否位于N37～H44位点的附近尚不清楚，但无疑为寻找该活性位点提供了可行性依据。当前，噬菌体随机肽库展示载体技术成为理想的选择肿瘤导向治疗载体的新方法。由于在肿瘤细胞中存在有多种高表达的已知与未知的细胞分子，如过度表达的特定受体分子，特异性的细胞表面突变蛋白等，因此，以肿瘤细胞表面或内部的天然受体作为筛选分子，采用多轮竞争洗脱的全细胞筛选方法，可找出与肿瘤 细胞特异性结合的噬菌体短肽。在实验中噬菌体与细胞的结合分在细胞表面结合和内化入细胞两部分。本实验中我们着重选取内化部分进行研究，为将来研制导向肿瘤细胞及抑制CD59的多肽药物奠定基础。高表达人CD59的CHO细胞虽非肿瘤细胞，却有体外多次传代等类似肿瘤细胞的生物学特性，且低表达非特异性蛋白，从而成为良好的筛选靶细胞。本研究通过加大每一轮肽库的投入量，减少作用时间，加强洗脱力度的方法，以提高筛选的特异性和亲和性。5轮筛选结果表明，回收率逐轮提高，克隆阳性率为60%，测序的6个克隆得到2种序列，我们将连续的6个氨基酸为一组与蛋白质数据库比对，发现-ACDLLM-短肽存在于肿瘤坏死因子Ⅰ型受体相关蛋白（TNFRⅠ）中。在肿瘤细胞逃逸免疫监视的过程中，细胞表面会出现TNFR等受体的下调，而近年来，TNF在卵巢癌等肿瘤的治疗中颇受关注。因此，以-ACDLLM-作为载体，可在卵巢癌细胞等肿瘤细胞中靶向与TNFR1的结合，并配合TNF的作用而提高药物的杀瘤效果。这提示合成短肽药物时，可从抑制CD59的活性和促进TNF的杀瘤作用及药物的导向作用多方面入手，以获得更为理想的杀瘤效果。在肿瘤的导向治疗中，药物对肿瘤细胞的高特异性、高选择性是其关键。为此，下一步研究应在体外合成这些短肽片段，并建立动物肿瘤模型进行体 内研究。
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［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（30170893）
（青岛大学医学院免疫学教研室，山东 青岛 266021）