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［摘要］ 目的 研究大鼠蛛网膜下隙出血（SAH）后脑水肿病理过程中水通道蛋白-4（AQP-4）的表达与脑水肿形成之间的关系。方法 采用大鼠断尾取血，枕大池注入自体血的方法制作大鼠SAH模型，用干湿质量法和免 疫组化法分别检测SAH后不同时间段脑含水量和AQP-4蛋白表达的变化。 结果 SAH后8 h，脑组织AQP-4蛋白在脑水肿区表达开始增强，至2 d达到高峰，此时脑组织严重水肿;第7天，AQP-4的表达已减少，脑水肿减轻。结论 SAH后AQP-4表达明显增强，与脑水肿呈正相关关系。AQP-4可能在SAH后脑水肿的形成过程中起重要作用。
［关键词］蛛网膜下隙出血;脑水肿;水通道蛋白4;大鼠，Wistar
THE EFFECT OF AQUAPORIN-4 ON BRAIN EDEMA FOLLOWING SUBARACHNOID HEMORRHAGE IN RATS
XU WEN-HU，YAO WEI-CHENG， LIU WEI-DONG， et al
（Department of Neurosurgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266023， China）
［ABSTRACT］ Objective To study the relationship between the expression of aquaporin-4 （AQP-4） and cerebral edema for- mation during the pathologic process following subarachnoid hemorrhage （SAH） in rats. Methods The SAH model was estab- lished by injecting autologous blood into the cisterna magna. The changes of brain water content were measured by the wet and dry weight methods. Immunohistochemistry was used to determine the changes of the expression of aquaporin-4 in cerebral cortex and thalamus on different times. Results The expression of AQP-4 in the edematous tissue increased at 8 hours following SAH. At 48 h， the expression of AQP-4 reached its maximum， and the brain edema became remarkable. On 7th day， the expression of AQP-4 in SAH group was still higher than that in the control group and the brain edema was unremarkable. Conclusion The expres-sion of AQP-4 increases remarkably after SAH and shows positive correlation with cerebral edema， which suggests that AQP-4 play an important role in process in cerebral-edema formation following SAH.
［KEY WORDS］subarachnoid hemorrhage;brain edema;aquaproin-4;rats，Wistar
脑水肿是蛛网膜下隙出血（SAH）病情恶化或 死亡的主要原因之一。然而，脑水肿发生发展的机制尚没有阐明，临床治疗也缺乏有效的方法。近年来人们发现，水通道蛋白4（AQP-4）与脑水肿的形成关系密切，在缺血的脑组织中AQP-4表达显著增 高，但AQP-4是否参与SAH后脑水肿的形成尚未见报道。为此，我们利用大鼠实验性SAH模型，采用免疫组化方法，研究SAH后AQP-4的表达规律，旨在深入探讨AQP-4在出血性脑水肿中的作用机制，为临床上脑水肿的防治提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物模型的制作
成年健康Wistar大鼠62只，3～4月龄，雌雄不拘，体质量250～300 g，由青岛市药品检验所提 供。随机分成正常对照组、假手术组和SAH后1 h 、8 h 、1 d 、2 d、3 d、5 d、7 d组，假手术组共14只，其他各组每组6只。SAH动物模型采用大鼠断尾 取血枕大池注入0.3 mL自体血的方法建立，将大鼠放回笼中，保持俯卧位，头低30°共30 min，让注入血液在重力作用下进入基底池，卫生饲养［1］。在各时间点将大鼠用体积分数为0.10的水合三氯乙醛（300 mg/kg ）腹腔注射麻醉后，左心室插管至主动脉，依次灌入生理盐水300 mL、40 g/L多聚甲醛400 mL ，灌注完毕开颅取脑，并切除脑干和嗅球部分。假手术组采用等容积生理盐水代替自体血注入正常大鼠枕大池内。
1.2 标本采集和组织切片制备
1.2.1 脑含水量的测定
采用干、湿质量法，取脑，沿中线切开，取其中一半脑组织，再将标本放于95～100 ℃红外线干燥箱内烘24～48 h至恒质量，称取干质量，干、湿质量均由电子分析天平称量（TG328型，精确到1/10 000 g）。脑组织含水量按 以下公式计算:组织含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%，干、湿质量均精确到0.1 mg。
1.2.2 脑组织切片制备
将脑切成块，厚5 mm，然后迅速放入含有1 g/L的DEPC和40 g/L多聚 甲醛的固定液中固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，常规梯度乙醇脱水、透明及浸蜡包埋。标本做冠状切片，厚度7 μm，粘于多聚赖氨酸处理后的玻片，室温保存，用于免疫组化染色。
1.3 检测方法
1.3.1 免疫组化检测
石蜡切片应用H2O2处理10 min后 ，体积分数0.10正常羊血清封闭30 min，一抗（浓度为1∶600）为兔抗大鼠AQP-4多克隆抗体，室温下孵育过夜，按SABC试剂盒（武汉博士德 公司）说明书进行操作，DAB显色系统显色后光镜观察，细胞浆出现棕黄色者为阳性细胞。阴性对照用0.1 mol/L的PBS代替一抗进行孵育。
1.3.2 图像分析
在400倍光学显微镜下，对水肿区进行免疫组化染色的同一部位的切片各5张进行观察，采用北航（C-2000B）生物医学图像分析系统进行细胞平均吸光度定量分析。
1.4 统计学方法
数据以 x±s 表示，用PPMS 1.0实用医学统计软件包对各组数据进行单因素方差分析，并用Dun-net t 检验进行比较及相关性检验。
2 结 果
对照组和假手术组脑组织AQP-4蛋白表达呈 弱阳性，脑组织含水量较低，细胞形态结构正常。SAH后8 h，脑组织AQP-4蛋白表达增强，第2天 表达最强，此后逐渐下降，1周后逐渐下降至正常水平;脑组织含水量逐渐增多，于第2天达最高峰，之后下降至正常水平。SAH不同时间皮质区和纹状体区AQP-4蛋白表达无明显差异。AQP-4蛋白表达和脑含水量呈正相关关系（r=0.925～0.951，P<0.01）。见表1。表1 各组SAH后皮质和丘脑脑水肿区AQP-4蛋白表达水平及脑含水量水平比较（略）
3 讨 论
3.1 SAH后脑组织水肿
脑水肿的产生是SAH后继发性脑缺血损伤的重要标志之一。SAH本身就相当于血-脑脊液屏障（BBB）功能的损坏，SAH时血细胞及血小板释放的 活性物质，构成了脑水肿的物质基础。SAH后脑血管痉挛的发生可导致不同程度的脑缺血低氧、微循 环障碍以及脑缺血后自由基、花生四烯酸代谢产物、兴奋性氨基酸和游离脂肪酸增加等，可导致严重的血管源性及细胞源性脑水肿。脑水肿后导致脑灌注压力的改变和细胞外环境的巨大改变，神经细胞钙超载和各种致细胞水肿的细胞因子的产生等，又可进一步加重脑组织缺血低氧，形成一个恶性循环，直至细胞死亡。
本文实验结果显示，SAH后8 h脑组织含水量 明显增加，于第2天达到高峰，之后含水量逐渐下降，至第7天时脑含水量达到正常水平。SAH后8 h 、1 d、2 d、3 d、5 d与对照组相比有统计学意义 （ P <0.05）。SAH后1 h、7 d与对照组相比无统计学意义（ P >0.05）。相关研究结果表明，SAH后4 h 脑组织水含量即明显增加，随时相递增，2 d时达到高峰，其皮质局部脑血流量有一个长达3 d的下降过程，说明SAH不仅可引起脑血管痉挛，也可引起脑水肿，这与文献报道一致［2，3］ 。
3.2 SAH后水通道蛋白4的作用自1988年AGRE等［4］
发现AQP-1以来，在人体内已经发现了11种水通道蛋白，广泛分布于动 物、植物、微生物中，它们存在于不同的组织器官中，对于维持机体的水平衡起着重要作用，并且与水平衡紊乱所造成的一些疾病有密切关系。在脑组织中主要有3种水通道蛋白:AQP-1、AQP-4和AQP-9［5］，其中AQP-4在脑组织中分布最广。1996年，AGRE等［6］研究发现，AQP-4广泛存在于中枢神经系统的星形胶质细胞膜、蛛网膜下隙、血管周围的胶质细胞、室管膜细胞、脉络丛及下丘脑渗透压感受区 器官。MANLEY等［7］研究发现，运用腹腔注射蒸馏 水法形成单纯细胞毒性脑水肿模型和大脑中动脉栓塞法建立脑缺血后水肿模型，AQP-4基因敲除小鼠的预后明显较野生小鼠为好，其脑组织中水含量及星形细胞足突水肿程度明显低于野生小鼠。在缺血性脑水肿模型中，与正常组相比，AQP-4基因敲除小鼠组的神经病理症状明显较轻，在缺血24 h后测 定大脑半球肿胀百分率下降了35%。TANIGU-CHI等［8］研究了大鼠大脑中动脉永久性栓塞后AQP-4 mRNA表达情况，发现在栓塞周围皮质，第1天AQP-4 mRNA表达轻微上升，第3天达最高峰，第7天仍处于较高水平，这与用MRI监测脑水肿的变化是一致的［9］。创伤性脑损伤实验显示，AQP-4表达水平与脑水肿的轻重呈正相关［10］。1998年，XI等向大鼠脑内注入全血时发现，脑水肿的高峰期在出血后第3天，持续1周仍不消退。本实验结果显示，SAH后脑水肿的发生发展与AQP-4蛋白的表达呈正相关。
3.3 AQP-4与SAH后脑水肿的关系
关于蛛网膜下隙出血后脑水肿与AQP-4的关系的研究国内外尚未见报道。本实验通过免疫组化的方法检测大脑皮质、纹状体区AQP-4蛋白的表达情况。在SAH后8 h AQP-4蛋白表达已明显高于正常水平，第2天达到峰值，以后逐渐回落，在1周时基本接近正常组水平，经统计学相关分析法检验证实，脑水肿与AQP-4蛋白的表达呈正相关，说明SAH后脑水肿的发生发展与AQP-4的过度表达有密切关系。并且AQP-4在皮质、纹状体的表达无明显差异。AQP-4在正常大脑和各种病理情况下对水转运的显著作用，尤其是在脑水肿的发生、发展及恢复阶段扮演了一个重要角色。近年研究显示，星形胶质细胞足板表达丰富的AQP-4 mRNA与BBB有关，在脑水肿情况下水通道对脑通透性平衡的恢复起着关键作用。形成BBB的胶质细胞终足上的AQP-4表达升高，将引起血管内水分透过BBB进入脑组织，此处的胶质细胞的破裂，导致BBB的破坏，进而加重脑水肿。另有研究表明，在BBB受损 的血管源性脑水肿模型中，AQP-4表达减少，而在细胞毒性脑水肿（BBB完整）模型中，AQP-4的表达无明显变化［11］ 。KIENING等［12］研究认为，在脑挫伤后8 h内AQP-4表达下降是细胞毒性脑水肿的原因，也反映了机体内在的防御机制，它可减轻胶质细胞水肿;同时指出在脑缺血早期，AQP-4表达也明显下降;于3 d后AQP-4的表达与水肿呈正比上升，而在基因敲除鼠模型中其脑水肿明显减轻。
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1 青岛大学医学院附属医院神经外科，山东 青岛 266003;
2 青岛大学医学院脑血管病研究所