茶多酚对D-半乳糖诱导衰老小鼠红细胞氧化损伤影响

　　［摘要］  目的 观察茶多酚对衰老小鼠红细胞氧化损伤的影响。  方法   对以D-半乳糖诱导衰老小鼠模型分  别以低、中、高剂量的茶多酚灌胃30 d，测定小鼠红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，红细胞膜Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量。结果 模型组红细胞SOD活性、Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量与正常对照组比较显著下降，茶多酚给药组小鼠红细胞SOD活性、细胞膜Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量较正常对照组明显增高，MDA含量降低，在各给药组中以茶多酚大剂量组的作用最强。结论茶多酚能增强机体抗氧化能力，减少自由基对生物膜的损伤，维持细胞膜的稳定性，具有抗衰老作用。   

　　［关键词］茶多酚;衰老;红细胞;超氧化物歧化酶;丙二醛

　　EFFECT OF TEA POLYPHENOL ON RED BLOOD CELLS OF AGING MICE INDUCED BY D-GALACTOSE 

　　WANG ZHEN-LI，CHEN XUE-HONG， WANG LI-HUA， et al  

　　（Department of Pharmacology， The First Sanatorium of Ji′nan Military Command   in Qingdao， Qingdao 266071，China）  

　　［ABSTRACT］Objective To investigate the effect and mechanism of tea polyphenol on red blood cells （RBC） in aging mice.  Methods The aging mice induced by D-galactose were given tea polyphenol at different doses for 30 days. The activity of SOD and   the MDA content in RBC，the activity of Na+-K+-ATPase and content of acetylneuraminic acid in RBC membrane were detected.   Results  Comparing with normal control group， the activity of SOD， Na+-K+-ATPase and the content of acetylneuraminic acid in   model group declined; the activity of SOD and Na+-K+-ATPase，the content of acetylneuraminic acid elevated， but the amount of  MDA declined. The optimal action of tea polyphenol appeared in high-dose group.   Conclusion  Tea polyphenol can enhance the  antioxidant ability human body，reduce the damage of free radical to cell membrane，maintain the stability of cell membrane and it   has antiaging effect.  
　　
　　［KEY WORDS］tea polyphenol; aging; erythrocytes; superoxide dismutase; malondiadehyde     

　　近几年来，国内外学者对茶多酚的生物学活性  进行了大量的研究，现已证明，茶多酚具有清除自由基、抗衰老、抗突变以及解毒等作用，其机制与其抗氧化作用有关［1，2］。衰老是分子、细胞、器官乃至机体整体功能衰退的综合复杂的生理、病理变化过程，机体在细胞代谢过程中不断产生的自由基，具有极强的氧化能力，而红细胞特别易受氧化损伤，所以成为研究细胞、组织衰老和氧化损伤的最好材料之一［3，4］。本文以D-半乳糖诱导昆明种小鼠衰老模型为实验对象，观察茶多酚对红细胞的影响。

　　1 材料和方法   

　　1.1 试剂  

　　实验所用茶多酚购自浙江农业大学茶叶系，纯度为99%，避光冷藏保存。分析纯D-半乳糖、对甲  苯磺酰胺（PMSF）、哇巴因购自爱普生物科技公司。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、ATP酶、唾液酸及蛋白定量试剂盒由南京建成生物制品研究  所提供。   

　　1.2 动物分组及给药  

　　昆明种小鼠50只，雌雄各半，2月龄，体质量18～ 21 g，由青岛市药品检验所提供。各组小鼠同  室分笼饲养，自由进食饮水。将小鼠随机分为正常对照组，D-半乳糖衰老模型组，茶多酚低、中、高3个剂量给药组，每组10只。首先，模型组及茶多酚给药各组小鼠每天颈后皮下注射D-半乳糖水溶液（经高压灭菌，剂量为110 mg/kg体质量），连续20 d。正常对照组每天颈后皮下注射等量9 g/L氯化钠溶液［5］。从第21天开始，茶多酚3个剂量组每天分别以1.0、2.0、4.0 g/（kg·d）茶多酚灌胃，正常对照组和模型组等量9 g/L氯化钠溶液灌胃，连续30 d。末次给药后24 h制备红细胞和红细胞膜，然后测定各项指标。   

　　1.3 红细胞膜制备  

　　肝素抗凝血以2 500 r/min离心5 min，用滴管吸出血浆层及白细胞层，用生理盐水悬浮红细胞后 3 000 r/ min离心20 min，弃去上清液，反复洗涤3次。分别加入30倍体积预冷的10 mol/L Tris、 0.25 mol/L EDTA （pH 7.4）充分溶血2 h，用高速低温离心机12 000 r/min离心20 min，得白色红细胞悬液2～3 mL，显微镜下观察红细胞形态。用改良LOWERY法测定红细胞膜蛋白浓度并控制在1.5～ 2.5 g/L，分装于一次性塑料管中，放-40 ℃冰箱保存，整个过程在0～4 ℃操作。  

　　1.4 红细胞SOD活性和MDA含量测定  

　　肝素抗凝血离心去除血浆和白细胞，用生理盐水悬浮红细胞后3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，反复洗涤3次，制备红细胞悬液，测定蛋白浓度，严格按SOD（微量邻苯三酚比色法）和MDA（硫代巴比妥酸比色法）测定试剂盒操作方法进行检测。   

　　1.5 红细胞膜Na+-K+-ATPase活性测定  

　　取含80 μg膜蛋白的悬液加入500 μL的反应  体系（60 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，30 mmol/LTris HCl，1 mmol/L ATP，1.5 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L EDTA，pH 7.4）中。37 ℃保温1 h，加入550 g/L TCA 5 μL终止反应。冰浴，3 000 r/  min离心后取上清液0.5 mL，加入定磷试剂，于640 nm 处测定吸光度值，代表总ATP酶活性。另测同样反应体系中加入0.1 mmol/L哇巴因的吸光  度值，此值为对哇巴因不敏感ATP活性，两值之差为Na+-K+-ATPase的活性。酶活性以每毫克蛋白质每小时释放无机磷微摩尔数（μmol·mg-1·h-1）表示。   

　　1.6 红细胞唾液酸含量的测定取制备好的红细胞膜蛋白液，应用唾液酸定量试剂盒于560 nm波长处测定吸光度值。   

　　2 结  果   

　　2.1 茶多酚对红细胞SOD活性和MDA含量影响  

　　与正常对照组比较，D-半乳糖诱导的衰老模型组小鼠红细胞SOD活性下降、MDA含量增高（P <0.05 、0.01）。茶多酚各剂量组红细胞SOD活性显  著增高，MDA含量降低，其中大剂量组的作用较明显（ P <0.05、0.01）。见表1。表1 茶多酚对红细胞SOD活性和MDA含量的影响（略）       
　　2.2  茶多酚对红细胞膜Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量的影响   与正常对照组比较，衰老模型组小鼠红细胞膜Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量则均显著降低（P <0.05 、0.01）。茶多酚各剂量组小鼠红细胞膜Na+ K+-ATPase活性和唾液酸含量显著增高（ P <0.05、0.01）。见表2。表2 茶多酚对红细胞膜Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量的影响（略） 

　　3 讨  论  

　　D-半乳糖诱导衰老小鼠模型是抗衰老研究的较好模型之一，根据衰老的“代谢失调学说”，糖代谢障碍、紊乱和失调，必然导致多种组织的能量代谢异常，导致衰老。有研究表明，该模型的衰老程度接近小鼠21月龄水平，并观察到类似衰老的各个组织系统的功能改变［6，7］。所以本文以D-半乳糖诱导的衰老小鼠为研究对象。结果显示，模型组小鼠的各项  指标与正常对照组比较有显著差异，说明模型诱导成功。由于红细胞的生理结构特点，特别易受氧化损伤，所以成为研究细胞、组织衰老和氧化损伤的最好材料之一。细胞衰老是整体衰老的基础，而细胞水平的改变主要表现在细胞膜上，因为细胞膜富含多不饱和脂肪酸，为自由基进攻的主要靶位。自由基进攻细胞膜，诱发膜上不饱和脂肪酸过氧化反应，引起膜脂间或脂质与膜蛋白之间的交联，导致膜的结构和功能发生改变［8，9］。SOD能清除机体产生的超氧离子，防止超氧离子的氧化作用。MDA是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的产物，能与膜蛋白或磷脂的游离氨基交联，使膜的结构破坏，功能减退，最终导致细胞衰亡，其含量的多少反映组织细胞的脂质过氧化速率或强度，故红细胞膜MDA含量可直接反映机体氧化损伤的程度［10］ 。本文结果表明，D-半乳糖诱导的衰老模型组小鼠红细  胞的SOD活性下降、MDA含量增高（P<0.05），茶多酚能显著提高衰老小鼠红细胞SOD活性，降低MDA含量，且具有量效关系（ P <0.05）。Na+-K+-ATPase是生物体内广泛存在的一种极为重要的膜酶，其重要功能是维持细胞内外的渗透压平衡、跨膜电化学梯度以及细胞的能量代谢，Na+-K+-ATPase活性的下降，将导致细胞内能量生成和离子转运障碍，从而影响细胞的功能，引起衰老［11］。有资料表明，生物体内Na+-K+-ATPase活性随增龄逐渐降低［12］。本研究通过建立D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型，并选择红细胞膜Na+-K+-ATPase活性作为检测指标，观察茶多酚对衰老小鼠红细胞膜Na  +-K+-ATPase活性的影响。结果表明，衰老模型组Na+-K+-ATPase活性明显低于正常对照组和茶多酚各剂量组，差异有显著性。提示茶多酚可以通过提高红细胞Na+-K+-ATPase活性发挥抗衰老作用。唾液酸是糖蛋白和糖脂糖链末端的残基，广泛分布在哺乳动物细胞膜表面，为细胞表面负电荷的主要来源，亦为胞膜受体的重要成分，参与细胞分化、识别、黏附等许多重要生理过程。红细胞膜上的唾液酸是红细胞发挥生理功能的重要物质基础，唾液酸含量减少是机体衰老和免疫功能降低的指标之一［13］。本研究结果表明，衰老模型组唾液酸含量明显低于正常对照组和茶多酚各剂量组，茶多酚通过提高红细胞膜唾液酸含量，增强机体免疫功能来抑制衰老。综上所述，茶多酚通过显著增强小鼠红细胞  SOD、Na+-K+-ATPase活性和唾液酸含量，降低细胞脂质过氧化而发挥抗衰老作用。

　　［参考文献］   

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　　［13］刘希英，黄振学，赵秀珍，等. 老年人红细胞膜唾液酸含量与红  细胞免疫功能的相关性［J］.  中华老年医学杂志，  1998，17（2）:  110.   

　　1 中国人民解放军济南军区青岛第一疗养院药剂科，山东 青岛 266071;

　　2 青岛大学医学院药理学教研室;
 
　　3 青岛市妇  女儿童医疗保健中心