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［摘要］目的 探讨老年性痴呆（AD）病人载脂蛋白E（apoE）基因多态性与淀粉样β蛋白前体16-17外显子（App16-17）表达之间的关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，检测25例AD病人及25例健康老年人的apoE基因型，同时应用相对定量的竞争RNA扩增聚合酶链反应（RT-PCR）技术，检测上述病人外周血单个核细胞中App16-17表达量。结果 AD组病人apoE ε4等位基因频率较对照组升高（ χ 2 = 8.67 ，P <0.01），apoE ε4等位基因携带者App16-17表达量较ε2、ε3等位基因携带者高，但差异无显著性。结论apoE ε4基因为老年性 痴呆的危险因子，apoE ε4等位基因对AD病人的App16-17表达量无显著影响。
［关键词］ 阿尔茨海默病;载脂蛋白E类;多态性，单核苷酸;淀粉样β蛋白前体
A CORRELATION BETWEEN APOLIPOPROTEIN E POLYMORPHISM AND β AMYLOID PRECURSOR PROTEIN IN PATIENTS WITH ALZHEIMER DISEASE
ZHANG WEI， TAN LAN， JIANG SAN-DUO
（Department of Emergency， East Campus of Qingdao Municipal Medical Group， Qingdao 266071， China）
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the relationship between the expressions of apolipoprotein E （apoE） gene polymor-phism and β amyloid precursor protein （16-17exons） in Alzheimer disease （AD）. MethodsThe polymerase chain reaction-re-striction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） was used to detect apoE genetype in 25 AD patients and 25 healthy age-matched controls. Meanwhile， The expression of β amyloid precursor protein 16-17exons （App16-17） in peripheral mononuclear blood cells were examined using quantitive competitive RT-PCR methods. ResultsThe increased frequency of apoE ε4 allele （ χ2 = 8.67，P <0.01） was found in AD. The expressions of App16-17 in different genotype groups were different， in which， ε4-carrier group were higher than in ε2- and ε3-carrier groups， but the differences were not statistically significant. Conclusion ApoE ε4 allele is a risk factor for Alzheimer disease. The expression of App16-17 in peripheral mononuclear blood cells is not signi- ficantly influenced by the apoE ε4 allele in the disease.
［KEY WORDS］Alzheimer disease; apolipoproteins E; polymorphism， single nucleotide; amyloid beta-protein precursor
老年性痴呆（AD）是潜伏性起病、缓慢进行性加重并由脑内原发性、退行性病变所致的痴呆。病理上主要是累及前脑基底、海马和大脑皮质，以神经元丧失、老年斑、神经原纤维缠结、细胞外淀粉样蛋白沉积、淀粉样血管病为特征。老年斑主要为淀粉样β蛋白前体（App）水解产生的淀粉样β蛋白（Aβ）构成。老年性痴呆病因为多源性，可由1、14、19和21号染色体或其他可能因子突变所致。近年来，利用转基因鼠模型研究发现，不同载脂蛋白E（apoE）的异构体对App的水解作用不同，表达人apoE4的老鼠比表达人apoE3的老鼠更容易形成明显的App沉淀。本实验应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，检测25例AD病人及25例健康老年人的apoE基因型，同时应用相对定量 的竞争RNA扩增聚合酶链反应（RT-PCR）技术，检测外周血单个核细胞中淀粉样β蛋白前体16-17外显子（App16-17）表达量，以探讨AD病人apoE基因多态性与App16-17表达之间的关系。
1 对象和方法
1.1 研究对象 所有病人均经一般体格检查，排除肾衰竭、肾病综合征、肝炎、肝硬化、甲状腺功能减退（未治愈）、肿瘤等可能影响血脂蛋白代谢的疾患。经过神经系统体格检查，颅脑影像学检查，简易精神状态检查法（MMSE）以及HANCHINSKI量表评分后，按照DSM-Ⅳ痴呆诊断标准（美国精神病协会制定的《精神障碍诊断与统计手册》第4版的诊断标准）分组。
1.1.1AD组 25例，男14例，女11例;年龄为64～78岁，平均（71.32±3.99）岁。教育程度:文盲 8例，小学7例，中学7例，大学3例。经CT或MRI 排除血管性痴呆（VD）。
1.1.2对照组 25例，为青岛大学医学院附属医院门诊健康查体者。男13例，女12例;年龄64～84岁，平均（71.44±6.95）岁。教育程度:文盲3例，小学8例，中学5例，大学9例。
1.2 研究方法 所有入选对象均抽清晨空腹静脉血5.5 mL，经EDTA抗凝，常规提取DNA、RNA，经紫外线分光光度计测定260 nm和280 nm波长处的吸光度值，要求二者之比大于2。
1.2.1apoE基因型检测 应用PCR-RFLP技术，检测25例AD病人及25例健康老年人的apoE基因型，参考文献［1］取apoE基因第4外显子中包含编码第112位和158位氨基酸的一段基因序列用于分析apoE基因多态性，扩增引物为F4:5′-ACA-GAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′，F6:5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。扩增产物长244 bp，经HhaⅠ限制性内切酶处理后，按酶切电泳图谱进行分型。
1.2.2App16-17表达的半定量检测 ①将RNA反转录成cDNA:在20 μL反应液中含有4 μL总RNA，随机引物（0.5 g/L）1 μL，RNAsin Inhibitor（4× 107U/L ）0.5 μL，dNTPs（10 μmol/L）2 μL，MgCl2 （25 μmol/L）4 μL，10×Buffer 2 μL，AMV反转录酶（2×107 U/L）1 μL和适量的DEP处理水。于 42 ℃ 90 min，52 ℃ 30 min，-20 ℃保存。②App16-17表达引物（上海市精神卫生中心江三多教授提供）设计:参考文献［2］取App基因第16、17外显子中包含编码App的一段基因序列用于合成App，扩增引物为App9:5′-GACAAATATCAAG-ACGGAGGAG-3′，App10:5′-CCACACCATGAT-GAATGGATGTG-3′，扩增产物长233 bp，称其为cApp。③参照模板引物设计:选择与VD、AD无关并在血细胞有表达的人类红细胞β血影蛋白基因为参照模板［3］。在扩增β血影蛋白基因的一对引物的5′ 端分别接上引物App9和App10的序列，引物为BS1-App9:5′-GACAAATATCAAGACGGAGGA-GGTGGCTGAGGCGTGGCTGATTGC-3′，BS3-App10:5′-CCACACCATGATGAATGGATGTG-TCTCAAAAGCCTCATGCCTC-3′，经过常规PCR后，可合成长154 bp片段，纯化DNA和紫外线分光光度计测定浓度。再稀释成100 μmol/L溶液待用（-20 ℃保存），称其为gApp。④竞争RT-PCR:每个样本同时进行4管PCR，每管中加入等量1 μg cApp和不等量的gApp（10、5、1和0.5 amol），引物 为App9和App10，200 μmol/L dNTPs，Taq酶和适量水，每管反应体积为50 μL。PCR循环顺序为:92 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共40周期，72 ℃延伸7 min。每样本的4管PCR产物在同一块含EB的1.5 g/L琼脂糖凝胶上点样电泳，100 V电泳1 h。每管PCR可形成两条DNA扩增带，gApp模板产物长为154 bp，cApp模板产物长为233 bp。⑤App的相对半定量:采用德国欧波同公司VIDAS图像分析系统将每样本的电泳图像输入电脑，对2条DNA带作吸光度扫描，获得吸光度值;再求得两个吸光度比值的log值，即log cApp16-17/gApp16-17。以4个不同amol浓度gApp 16-17值为 X 轴，而相应的cApp16-17/gApp16-17吸光度比值的log值为 Y 轴，进行直线回归分析，求出cApp16-17/gApp16-17为1（log cApp16-17/gApp16-17=0）时，其相应gApp16-17的amol值，即为该检测样本的cApp16-17的相对半定量的表达值。
1.2.3资料统计方法 采用卡方检验、方差分析及 t 检验。
2 结果
2.1 apoE基因型频率分析 对AD组和对照组进行基因型分析可见，两组均以ε3/ε3型最多，而AD组的ε3/ε3型较对照组显著减少（ χ2 =11.97，P <0.01）。AD病人ε3/ε4和ε4/ε4基因型频率增高。见表1。
2.2 apoE等位基因频率分析 AD组ε3等位基因频率较对照组降低（ χ2 = 5.22 ，P <0.05），ε4等位基因频率较对照组升高（ χ2 = 8.67，P <0.01）。见表2。
2.3两组App16-17表达量比较 经竞争RT-PCR检验，AD组病人的App16-17表达量为（3.58±0.90）pmol/g，95%可信区间为 3.93～ 3.23;对照组为（2.31±0.56）pmol/g，95%可信区间为2.56～2.06，两组差异有显著性（ t= 5.96 ，P < 0.01 ）。
2.4两组不同apoE等位基因间App16-17的表达 将两组病人按apoE等位基因分成ε2等位基因携带者（ε2/ε2、ε3/ε2、ε2/ε4），ε3等位基因携带者（ε2/ε3、ε4/ε3、ε3/ε3），ε4等位基因携带者（ε4/ε2、ε4/ε3、ε4/ε4）。不同等位基因携带者之间App16-17水平比较显示，ε4等位基因携带者App16-17水平高于ε2、ε3等位基因携带者，但差异无显著性（ P >0.05）。见表3。
表1 两组apoE基因型频率（略）
表2 两组等位基因频率（略）
表3 两组不同apoE等位基因间App16-17水平比较（略）
2.5apoE ε4等位基因与App16-17表达量的关系 对照组具apoE ε4等位基因和无apoE ε4等位基因者App16-17表达量分别为（3.04±0.35）、（ 2.23± 0.50）pmol/g，AD组为（3.76±0.64）、（ 3.38± 1.03）pmol/g，两组中有ε4和无ε4等位基因者间App16-17表达量无显著性差异（ P >0.05）。
3 讨论
apoE基因位于人类第19号染色体上。编码区第4个外显子单个碱基的替换，即T-C互换形成3个遗传性共显性等位基因ε2、ε3、ε4，这3种等位基因中任何两种表达可产生6种不同的表型，3种纯合子（ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4），3种杂合子（ε2/ε3、ε3/ε4、ε2/ε4），apoE等位基因ε4首先被确定为AD的易感基因［4］。App基因定位于人类第21号染色体上，由该基因的第16和17外显子编码的App水解片段Aβ肽（即App16-17），被证实为AD病人脑中老年斑的主要蛋白成分。正常App水解代谢仅仅产生和释放少量的Aβ，而在病理条件下，如果某种因素如神经元变性，能够促进App的表达上调，可以改变App的代谢，使Aβ增加。App基因100～207区间上存在apoE的结合位点，3种载脂蛋白apoE2、3、4均可与App分子结合。将apoE与App751共表达于COS1细胞，发现apoE可干扰COS1细胞的App代谢分泌过程，使细胞分泌型App减少［5］。STRITTMATTER［6］通过对AD病人脑脊液（CSF）成分分析证实，apoE是淀粉类基因蛋白质的病理性伴侣。而且，apoE ε4等位基因的出现频率在对照组是 0.15 ，在 AD 组是 0.50 。尸体解剖的神经病理学研究证明Aβ确实和apoE稳定地联系在一起。而且，AD个体存在apoE4的剂量依赖性增加［7］。另外，人们在CSF、血浆、正常人及AD病人脑组织匀浆中，发现了apoE和一些可溶Aβ的一部分联结的现象［8］。研究显示，apoE在淀粉样蛋白形成过程中起动力学抑制因子作用，通过作用于淀粉样蛋白的“成核”和纤维形成，影响App的β折叠，进一步影响淀粉样蛋白的沉积［9］。apoE还可能通过apoE受体导致神经纤维中的Aβ的清除。另外，影响Aβ清除的方法还可以通过Aβ由脑细胞外进入系统循环的运输来实现。本实验采用病例对照的方法，严格筛选病人，应用竞争RT-PCR技术，测定存活的AD病人和健康老年人的外周单个核细胞中App16-17的相对半定量。同时，应用PCR-RFLP技术，检测上述老年人的apoE基因型，证实AD病人ε3/ε4和ε4/ε4基因型频率增高，apoE ε4等位基因是AD的危险因子，apoE ε4等位基因对AD病人的App16-17表达量无显著性的影响。本实验表明，apoE ε4等位基因对App表达无影响，与国外文献报道转基因动物的App表达增高结果不同，可能与检测样本量小、定量不够精确有关。因此，应进一步进行更大样本的临床分析，同时开展具有apoE各等位基因和App基因突变的AD、VD转基因动物的App16-17表达程度的研究，探索引起App16-17过度表达的原因，从而为AD的诊断和治疗带来开拓性进展。
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（本文编辑 马伟平）
（青岛市市立医院东院区急诊科，山东 青岛 266071; 青岛大学医学院附属医院神经内科; 上海市精神卫生中心）