PTEN基因在脑胶质瘤中的表达

    ［摘要］  目的  探讨抑癌基因PTEN在脑胶质瘤组织中的表达情况及其临床意义。方法  应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法，检测45例胶质瘤组织与23例正常脑组织PTEN基因外显子19、58 mRNA表达情况。结果  在45例脑胶质瘤组织中，外显子19 PTEN mRNA相对表达量为0.40±0.19,外显子58 PTEN mRNA相对表达量为0.38±0.16。在正常脑组织中，外显子19 PTEN mRNA相对表达量为0.58±0.21,外显子58 PTEN mRNA相对表达量为0.64±0.17。脑胶质瘤组织和正常脑组织中PTEN mRNA表达水平有显著性差异(t=3.61、6.21,P＜0.01)。PTEN mRNA的表达水平与病人性别、年龄无关（t或t′=0.18～0.70,P＞0.05）。但随着临床分期的增高其表达水平明显降低(t或t′=4.16、4.69,P＜0.01)。结论  PTEN mRNA表达水平的异常在脑胶质瘤的发生和发展过程中起着重要作用。

　　［关键词］  基因,PTEN;胶质瘤;基因表达

    EXPRESSION OF PTEN GENE IN HUMAN GLIOMAYIN WEINING, CUI JIE, LIU LONGXI, et al (Department of Neurosurgery, Hiser Medical Group of Qingdao, Qingdao 266033,China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of tumor suppressor PTEN mRNA in human glioma and to elucidate its clinical significance.MethodsThe expressions of PTENextron 19, 58 mRNA were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) in 45 cases of glioma and 23 cases of normal brain tissues. ResultsThe expressions of extrons 19 and 58 PTEN mRNA in glioma were 0.40±0.19 and 0.38±0.16, respectively，while they were 0.58±0.21 and 0.64±0.17 in normal brain tissues. The difference was significant between them (t=3.61,6.21;P<0.05). The expression levels of PTEN mRNA decreased with the increase of the tumor grade (t or t′=4.16,4.69; P＜0.05), but not correlated with age and sex (t or t′=0.18-0.70, P>0.05).ConclusionThe abnormal expressions of tumor suppressor gene PTEN play an important role in the occurrence and development of glioma.

　　［KEY WORDS］gene, PTEN; glioma; gene expression  

    PTEN是1997年发现的定位于人类10号染色体的抑癌基因，是一种与张力蛋白和辅助蛋白高度同源的磷酸酶。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法，对脑胶质瘤组织和正常脑组织中PTEN mRNA的表达情况进行了检测，旨在探讨PTEN基因在胶质瘤发生、发展中的作用及其临床意义。现将结果报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  标本及试剂45份胶质瘤组织与23份正常脑组织为2003年2～7月我院手术切除的标本。45例病人中，男27例，女18例；年龄12~73岁。所有组织均经病理学诊断证实。逆转录试剂盒由Promege公司生产，TRIZOL试剂由GIBCO公司生产，引物由上海生物生化工程公司生产。

    1.2  RNA提取和cDNA合成用TRIZOL试剂提取组织RNA，用逆转录试剂盒提供的标准条件进行逆转录反应，以所获取的cDNA作为PCR反应模板。

    1.3  半定量RTPCR检测PTEN mRNAPCR反应所用引物序列及其扩增片段参见表1，内参照采用GAPDH。25 μL反应体系含10×buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 μL，dNTP 0.25    μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，PTEN基因引物0.5 μL，GAPDH引物0.5 μL，cDNA 2 μL。PCR反应条件是：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，56 ℃退火4 s，72 ℃延伸1 min，扩增40个循环，最后72 ℃延伸10 min。表1  PCR引物序列及扩增片段长度

　　1.4  结果观察分别取PCR扩增产物10 μL、Marker 2 μL、溴酚钠2 μL在80 V电压下电泳10 min。电泳结果在紫外线显示仪下观察。利用VADAS 2.1系统(德国OPTON公司生产)进行图像分析，以PTEN/GAPDH比值作为PTEN mRNA的相对表达量。以PTEN/GAPDH比值＜0.2为PTEN mRNA失表达。

    2  结    果

    2.1  胶质瘤和正常脑组织中PTEN mRNA表达在45例脑胶质瘤组织中，其外显子19 PTEN mRNA的相对表达量为0.40±0.19，外显子58 PTEN mRNA的相对表达量为0.38±0.16。正常脑组织中，外显子19 PTEN mRNA相对表达量为0.58±0.21，外显子58 PTEN mRNA相对表达量为 0.64±0.17。结果表明，胶质瘤组织和正常脑组织中PTEN mRNA表达水平有显著性差异(t=3.61、6.21,P＜0.01)。

    2.2  胶质瘤组织PTEN mRNA表达水平与临床病理特征的关系PTEN mRNA的表达水平与病人性别、年龄无关（t或t′=0.18～0.70,P＞0.05）。但随着临床分期的增高其表达水平明显降低(t或t′=4.16、4.69,P＜0.01)。见表2。

    2.3  脑胶质瘤组织中PTEN mRNA失表达率在29例脑恶性胶质瘤组织中，其外显子19 PTEN mRNA的失表达率为72.4%(21/29)；外显子58 PTEN mRNA失表达率为65.5%（19/29）。表2  胶质瘤组织中PTEN mRNA表达水平与临床病理特征关系

　　3  讨    论

　　PTEN是新近发现的具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，通过其脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的作用对细胞内蛋白质磷酸化水平进行精细调节，影响细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附和迁移等许多生物学行为。在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要的作用。有研究表明，PTEN基因突变与许多恶性肿瘤的发生密切相关［1］，然而对于在胶质细胞瘤发生、发展过程中是否有PTEN基因表达水平的异常，目前报道较少。有资料表明,在脑胶质细胞瘤组织中，PTEN基因蛋白的失活率高达70%~80%［2］。在对PTEN基因蛋白失活的研究中，基因突变是一个重要原因，其突变率各家报道不一。这些研究显示，在脑肿瘤组织中存在PTEN基因的突变，其中的一些突变将导致转录甚至蛋白水平的异常。然而，PTEN基因表达产物的异常也可能与基因突变无关。WANG等［3］在研究前列腺癌时并没有发现PTEN基因突变，只有1例DNA纯合性缺失，但其余9例中有5例存在PTEN mRNA和蛋白的缺失或低水平表达。说明PTEN基因存在转录水平的调控。从本研究结果来看，正常脑组织PTEN mRNA的表达无异常，脑胶质细胞瘤PTEN mRNA表达缺失主要存在于高级别胶质细胞瘤中，这一点与基因突变相似。同时，本文研究结果还显示，在29例脑胶质瘤组织中，外显子19 PTEN mRNA的失表达率为72.4%；外显子58 PTEN mRNA的失表达率为65.5%。有资料统计，多形性胶质母细胞瘤DNA突变率为26%~44%［4］。PTEN mRNA表达缺失率远高于DNA突变率。说明基因表达异常并不完全由基因突变所致。从PTEN基因的结构来看，5′端存在较长的非翻译区，并含有许多CpG岛结构，作为肿瘤抑制基因PTEN可能和其他一些肿瘤抑制基因一样，由于启动子区域的甲基化而导致转录完全阻断［5］。针对这一问题，WANG等［3］用去甲基试剂使前列腺癌中的PTEN mRNA完全恢复，提示该基因CpG岛存在甲基化。本研究还显示，在胶质细胞瘤病理分期Ⅲ、Ⅳ期组织内PTEN mRNA的表达显著低于Ⅰ、Ⅱ两期，说明PTEN mRNA的低表达可能促进了肿瘤组织由高分化向低分化演进的过程。HAIER等［6］研究显示，PTEN可通过丝苏氨酸磷酸酶的作用抑制该细胞对细胞外基质的稳定黏附。目前的研究认为，PTEN主要通过调节P130蛋白、基质金属蛋白酶和血管内皮细胞生长因子的活性影响肿瘤细胞的生长、侵袭等生物学行为［7］。我们的实验结果从分子水平初步证实,PTEN表达降低在脑胶质细胞瘤的发生、发展过程中可能起着非常重要的作用，其具体作用机制尚未完全清楚，对该基因的进一步研究，将有可能从分子水平进一步揭示脑胶质细胞瘤的发病机制。

    ［参考文献］

    ［1］KIM S K， SU L K， OH Y， et al． Alteration of PTEN,a candidate tumor gene,and its homologue PTH2,in small cell lung cancer cell lines［J］． Oncogene, 1998,16:89 ．

    ［2］肖绍文，谢小熏，陈维平,等． 脑肿瘤PTEN蛋白的表达［J］． 中国肿瘤， 2000，9（7）：332．

    ［3］WANG S I， PUB J， LI J ， et al． Somatic mutation of PTEN in glioblastoma maltiforme in juvenile polyposis coli［J］ ． Nat Genet, 1998,18:12．   

    ［4］肖绍文，谢小熏，罗国荣,等． 多形性胶质母细胞瘤Pten/MMAC1/TEP1基因的表达研究［J］． 广西医科大学学报， 2000，9（7）：332．

    ［5］MERLO A，  HEMAN J G，  MAO L，  et al．  5 cpG island methyllation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppression p16/CDKN2/MTS in humancancer［J］．  Nat Med,  1995,1:686．

    ［6］HAIER J，   NICOSON G L．   Timedependendent dephosphorylation through serine/threonine phosphatases is required for stable adhesion of highly and poorly metastatic HT29 colon carcinoma cell lines to collagen［J］． Anticancer Res, 2000,20:2265．

    ［7］TAMURA M， GU J， MATSUMOTO K， et al． Inhibition of cell migration,spreading,and focal adhesions by tumor suppressor PTEN［J］． Science, 1998,280:1614． 

    （1  青岛海慈医疗集团神经外科，山东 青岛  266033；  2  青岛市胸科医院；  3  青岛大学医学院附属医院神经外科）

　（本文编辑  厉建强）