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摘要］ 目的 探讨细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）对乳癌诊断及预后判断的意义。方法 采用免疫组织化学SP法对78例乳腺浸润性导管癌Cyclin D1表达进行检测，并结合雌激素受体（ER）表达情况，对两者关系以及预后进行分析。以37例乳腺腺病和乳腺不典型增生作为对照。结果 对照组及乳癌组Cyclin D1阳性表达率分别为18.92%和55.13%，差别有统计学意义（χ2=7.291，P<0.01）。Cyclin D1阳性率在乳癌高分化组为47.62%，中分化组为61.76%，低分化组为17.39%，各组间差别有显著统计学意义（χ2=11.008，P<0.05）。ER阳性乳癌病人Cyclin D1阳性表达率高于阴性病人，差别有统计学意义（χ2=4.019，P<0.05）。Cyclin D1（+）ER（+）组预后与Cyclin D1（+）ER（-）及Cyclin D1（-）ER（-）组比较差别有统计学意义（χ2=4.501、3.992，P<0.05），而与Cyclin D1（-）ER（+）组比较差别无统计学意义。结论 Cyclin D1的表达是肿瘤发生中的早期事件，参与癌前病变的发生并影响癌细胞分化程度。Cyclin D1在乳癌中表达与病理分级、ER状态有关。Cyclin D1异常表达的ER（-）乳癌病人预后较差，而Cyclin D1异常表达的ER（+）乳癌病人预后最好。
［关键词］ 细胞周期蛋白D1； 乳腺肿瘤； 免疫组织化学；受体,雌激素
EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF Cyclin D1 IN BREAST CANCERWANG MEI, SUN GUANYU, QU YANGANG, et al(Department of Breast Surgery, The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266042, China)
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of cyclin D1 in breast cancer and to evaluate its clinical significance in predicting its prognosis. MethodsCyclin D1 was measured in 78 cases of breast cancer tissues and 37 cases of benign disease by immunohistochemistry SP method. The results were analyzed and compared.ResultsThe positive rate of cyclin D1 in breast cancer in different pathologic stages was 47.62% (G1), 61.76% (G2) and 17.39% (G3), respectively. In benign disease, it was 6/17 （35.29%, atypical ductal hyperplasia） and 1/20 （5.00%, common breast disease）. The difference was significant between the cancer and benign one. The expression of cyclin D1 in the cancer was significantly higher than that in benign disease （χ2=7.291，P<0.01）. Their expression was related to pathologic stage (χ2=11.008,P<0.01). Analysis of the relationship of cyclin D1 and estrogen receptor (ER) showed that the positive rate of cyclin D1 in ER (+) tissue was higher than ER(-) tissue (χ2=4.019, P<0.05). The difference between the groups of Cyclin D1 （+） ER （+） and cyclin D1 （+） ER （-） was significant (χ2=4.501，P<0.01). ConclusionOverexpression of cyclin D1 plays an important role in the differentiation and development of cancer. The expression of cyclin D1 in breast cancer is related to pathologic stages. The high expression of cyclin D1 protein and positive expression of ER is highly identical in breast cancer. Overexpression of cyclin D1 predicts poor prognosis in ERnegative patients and good prognosis in ER positive.
［KEY WORDS］cyclin D1； breast neoplasms; immunohistochemistry; receptors, estrogen
乳癌是人类常见的恶性肿瘤，发病率占女性恶性肿瘤的第一位［1］。研究表明，应用雌激素受体(ER)拮抗剂他莫西芬（Tamoxifen）治疗乳癌，可明显降低乳癌的复发率，增加病人生存期及减少对侧乳房癌变概率，但仍有20%ER阳性乳癌病人治疗无效［2］。细胞周期素（Cyclins）是20世纪90年代发现的细胞增殖周期重要的调控因子［3］，与ER在乳癌细胞中的表达呈高度一致性，并推测雌激素可能通过Cyclin D1介导增殖作用［5］。本研究拟检测乳癌组织中Cyclin D1的表达情况，并结合病人的临床资料及预后进行分析。
1 材料与方法
1.1 标本及来源本研究选取青岛市中心医院乳腺外科1996~1999年间乳腺恶性肿瘤根治或改良根治术后石蜡包埋组织78例，手术前均未接受化疗和其他药物治疗。取材处为肿瘤组织中心部位及周边部。标本均经40 g/L缓冲甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。同时，取17例不典型增生及20例乳腺病组织作对照。
1.2 一般资料78例均为女性；年龄36~73岁，平均（54.79±9.60）岁，>50岁54例，≤50岁24例。按1981年WHO制定的乳癌分类标准［4］均为乳腺浸润性导管癌。原发部位:外上象限56例，其他22例。肿瘤直径：≤2 cm者28例，>2 cm者50例。病理分级:G1者21例，G2者34例，G3者23例。淋巴结转移52例，伴乳区转移1例，浸润皮肤及胸肌4例；无淋巴结转移26例。TNM分期:Ⅰ期28例，Ⅱ期22例，Ⅲ期28例。病人系术后口服他莫西芬20 mg，每日2次，共2年，并按较正规的方案接受化疗者（根据病情给予经典CMF及CEF方案）。
1.3 方法Cyclin D1单克隆抗体、SPKITT9000试剂盒均由美国ZYMED公司提供，防脱片剂APES、显色剂DAB为北京中山生物技术有限公司产品。按试剂盒说明书操作。光学显微镜下以细胞核中存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性。400倍光学显微镜下随机计数10个视野的癌细胞，根据染色细胞数量分为4级:阳性细胞<25%为(-),阳性细胞25%～49%为(+),阳性细胞50%～74%为(),阳性细胞≥75%为()。实验资料用NCSS统计软件包进行。率的比较采用χ2检验。
2 结 果
2.1 Cyclin D1表达Cyclin D1颗粒在乳癌细胞的细胞核中呈棕黄色染色，于核边缘近核膜处浓聚，细胞浆中无表达。在良性病变中Cyclin D1颗粒分布于细胞核，未见于细胞浆。
2.2 Cyclin D1表达与临床病理参数相关性对照组及乳癌组Cyclin D1阳性表达率分别为18.92%（7/37）和55.13%（43/78），差别有统计学意义（χ2=7.291，P<0.01）。乳癌组织中Cyclin D1表达与年龄、临床分期、淋巴结状态、肿瘤大小及部位无关（P>0.05），而与组织分化程度和ER阳性表达有关（P<0.01、0.05）。见表1。
2.3 随访结果随访78例病人，5年随访复发和（或）转移29例。乳癌Cyclin D1表达阳性者11例（31.43%），乳癌Cyclin D1表达阴性者18例(41.86%)，两组比较差异无显著性(χ2=1.267，P>0.05)。Cyclin D1（+）ER（+）组预后与Cyclin D1（+）ER（-）及Cyclin D1（-）ER（-）组比较差别有统计学意义（χ2=4.501、3.992，P<0.05），其余各组比较差别无统计学意义（χ2=0.063~2.633,P>0.05）。见表2。表1 乳癌组织中Cyclin D1表达与临床病理参数相关性.
3 讨 论
细胞周期蛋白又称周期素，是细胞周期中短暂出现的基因产物,具有严格的顺序性，与特定的细胞周期蛋白依赖性酶（CDK）结合构成复合体，参与细胞周期调控，然后降解。Cyclin分为Cyclin A~E，CDK可分为CDK1~5［4］，其特异结合在细胞不同周期，Cyclin D1CDK4控制G1期进程，Cyclin ECDK2控制S期入口，Cyclin ACDK2控制S期进程，Cyclin BCDK1控制M期入口。在细胞周期中，G1期的调节因子与癌变关系最为密切，细胞一旦越过G1/S期这一调控点，细胞周期的行进就变得不可逆。因此，研究Cyclin D的作用将具有更重要的意义。Cyclin D家族包括3个成员：Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3。乳癌和头颈部鳞癌组织中主要表达Cyclin D1。Cyclin D1在正常细胞周期G0期开始合成，其水平在G1中期达高峰，S期开始降解，在其后的周期中维持低水平。在正常细胞中Cyclin D1被认为能促进细胞周期，与细胞增殖有关。SICINSKI等［5］设计出Cyclin D1基因缺乏的小鼠，其乳腺组织在妊娠期不能形成导管分支和乳腺小叶。显示Cyclin D1与组织形成有关，对组织的功能似乎没有影响。此功能与Cyclin D1促进细胞癌变的机制密切相关。BARTEK等［6］利用免疫组化方法，在乳腺中发现静止期和增殖期乳腺免疫染色很弱，Cyclin D1在正常乳腺组织中的低表达是生理状态。本研究显示，Cyclin D1阳性率在乳癌不同分化组差别有统计学意义（P<0.01）。提示Cyclin D1表达参与肿瘤的发生过程，是肿瘤发生中的早期事件，参与癌前病变的发生及癌细胞的组织分化程度。乳癌内分泌治疗就是改变激素依赖肿瘤生长所需要的内分泌环境，使肿瘤细胞增殖停滞于G0/G1期，从而达到临床缓解。但仍有许多问题未解决，如治疗的有效率只有30%，从细胞周期调控角度寻找突破口最为人们所关注。许多研究表明，Cyclin D1的表达可能受多种因素控制［7］，现已证实prb、雌激素生长因子可调控Cyclin D1的表达。ER在乳癌的形成、发展及对激素的反应中起关键作用。有学者研究表明，抗雌激素治疗的早期变化就有Cyclin D1表达减少，而经抗雌激素物质控制的T47D细胞在异位Cyclin D1的作用下又可恢复细胞周期进程［8］，可以推测雌激素对乳腺肿瘤的作用可能通过Cyclin D1的途径。本研究显示，乳癌组织中Cyclin D1表达与ER呈正相关，提示雌激素促进乳癌发生的原因之一可能与其诱导Cyclin D1基因扩增有关。1974年在美国Bethesde会议上综合了世界上各国400多份各种方式的雌激素治疗报告，表明未经ER测定的乳癌病例内分泌治疗的有效率只有30%；ER阳性病人有效率为50%~60%；ER、PR均阳性的乳癌对雌激素治疗的敏感性更高，但无论如何也达不到100%［3,8］。本研究所选78例病人，系术后口服他莫西芬20 mg，每日2次，共2年，并按较正规的方案接受化疗者。其中Cyclin D1（+）ER（+）组预后最好。我们认为，ER（+）病人内分泌治疗的有效率小于60%的原因是，约40%的病人Cyclin D1（-），虽然药物阻断了雌激素与ER结合，但缺乏Cyclin D1介导而不能发挥作用。认为应选择Cyclin D1（+）ER（+）的病人给予内分泌治疗。细胞周期调控紊乱是肿瘤细胞特征之一。许多癌基因、抑癌基因作用于细胞周期的关键环节对细胞增殖、生长、分化进行调控，参与肿瘤的发生发展［9］。但细胞周期调控的关键因子在临床相关性及指导临床应用方面还未取得一致结论，还需做更多的工作。
［参考文献］
［1］崔全才，周旭东. 乳癌Cyclin D1的扩增和表达与预后的关系［J］. 临床和实验病理学杂志， 2000，16（6）：525526.
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［5］SICINSKI P, DONAHER J L, PARKER S B, et al. Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast［J］. Cell, 1995,82(4):621630.
［6］BARTEK J, LUKAS J, BARKOVA J, et al. Perspective defects in cell cycle control and cancer［J］. J Pathol, 1999,187:9599.
［7］SMPSON J,QUAN D,OMALLEY F,et al.Amplification of CCND1 and expression of its protein product, Cyclin D1 in ductal carcinoma in situ of breast ［J］. Am J Pathol, 1997,151:161.
［8］杨红斌，付京，张盈华. 乳腺癌组织中孕激素受体与雌激素受体DNA结合功能关系的研究［J］. 中国肿瘤临床， 1999，26（10）：745.
［9］ALTUCCI L, ADDEO R, CICATIELLO L, et al. 17 betaestradiol induces Cyclin D1 gene transcription, p36D1p34CDK4 complex activation and p105Rb phosphorylation during mitogenic stimulation of G1arrested human breast cancer cells［J］.Oncogene, 1996,12(11):23152324.
（1 青岛大学医学院第二附属医院乳腺外科，山东 青岛 266042; 2 青岛大学医学院附属医院普外科）
（本文编辑 马伟平）