急性白血病病人网织血小板变化及其临床意义

【摘要】  目的 探讨急性白血病（AL）病人外周血网织血小板（RP）变化及其临床意义。方法 用流式细胞仪(FCM)检测32例不同类型AL病人的RP、血小板（PLT），动态观察7例病人化疗过程中的RP、PLT的变化，并与12例健康查体者（正常对照组）进行比较。结果 AL初治组、复发难治组RP、PLT低于正常对照组，差异有显著性（F=7.320、6.950,q=4.318～5.897,P<0.05）。缓解组化疗前RP高于化疗后(t=2.806,P<0.05)；未缓解组化疗前RP低于化疗后（t=3.128,P<0.05）。7例初治AL病人骨髓抑制期RP、RP%低于骨髓恢复期（F=7.061、9.345,q=3.932～5.983,P<0.05）。AL病人RP%与PLT呈负相关（r＝-0.373,P<0.05）。结论 RP可反映AL病人的不同病理状态,也是化疗后骨髓恢复的一个早期且敏感指标。

【关键词】  血小板计数；急性白血病；药物疗法

    CHANGE OF RETICULATED PLATELETS AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE IN ACUTE LEUKEMIA XIAO SHUXIN, ZHAO HONGGUO, MENG FANJUN,  et al(Department of Endocrinology, Qingdao Hiser Hospital, Qingdao 266033, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the change of reticulated platelet (RP) in acute leukemia (AL) and to evaluate its significance.MethodsRP and PLT were detected and observed during chemotherapy in 32 patients with different type of AL, which were compared with 32 normal controls.ResultsThe RP and PLT in initiallytreated and refractory or relapse AL patients were lower than normal controls (F=7.320, 6.950;q=4.318-5.897;P<0.05). Before chemotherapy, the RP of AL, before remission, was higher than after chemotherapy (t=2.806, P<0.05), while the RP without remission, before chemotherapy, was lower than after chemotherapy (t=3.128,P<0.05). The RP and RP% of seven initiallytreated AL, in myelosuppression stage, were both lower than in recovery phase (F=7.061, 9.345;q=3.932-5.983;P<0.05). The RP% of AL was negatively related to PLT （r＝-0.373, P<0.05）.ConclusionRP can reflex the different status of AL, and is an earlier and sensitive index to predict the recovery of bone marrow after chemotherapy.

    ［KEY WORDS］platelet counts；acute leukemia；drug therapy

    网织血小板(RP)是外周血经新亚甲蓝染色镜检观察到的有网状染色物的部分血小板，不含核或DNA成分，却含有少量的mRNA和粗面内质网，保留了合成少量蛋白质的能力，为血液循环中最年轻的血小板［1］。进行RP计数可能预示着外周血血小板（PLT）的后续升高。急性白血病(AL)病人PLT减少的原因复杂，在诊治过程中骨髓的功能状态变化大，常规判断白血病的不同疾病状态是通过PLT或骨髓穿刺，但PLT升高较骨髓造血功能恢复明显滞后，且检验误差大，影响因素多，多次骨髓穿刺给病人带来痛苦。而应用流式细胞仪(FCM)检测RP准确、简单，采集外周血量少，勿需骨髓穿刺。资料表明，在人类给予引起巨核细胞释放PLT的刺激2 d后PLT计数升高［2～4］。本文应用FCM检测不同类型AL病人外周血PLT和RP，旨在观察RP在AL治疗过程中的动态变化和意义。现将结果报告如下。

    1  资料和方法

    1.1  研究对象

    收集青岛大学医学院附属医院血液内科2003年7月～2003年11月住院并接受化疗的AL病人32例，男18例，女14例；年龄18～60岁，中位年龄30岁。其中初治19例，复发难治4例，巩固化疗9例。初治者缓解14例，未缓解5例。所有AL病人均经骨髓细胞学、免疫学和骨髓病理学检查证实，采用标准化疗方案治疗。参考CHAO等［5］标准将化疗后骨髓变化分为骨髓抑制期和早期恢复期，前者WBC<1.0×109/L、PLT<10×109/L，且在随后的48 h内PLT升高<10×109/L或需要输注血小板；如果连续几天PLT计数较低，以最早的低PLT计数为骨髓抑制最低点，取此时的RP值。后者WBC<10×109/L、PLT<10×109/L，取在随后的48 h内没有输注血小板而其升高20×109/L时的RP值。

    正常对照组12例，均来自健康查体者，男７例，女５例；年龄20～50岁，平均29岁。身体健康，无吸烟及嗜酒史，无心、肝、肾等重要脏器疾病史。

    1.2  标本采集及处理

    取受检者空腹肘静脉血2 mL，EDTAK2（终浓度1.5 g/L）抗凝，静置1.5 h，取上清离心，在沉淀中加入50 μL PBS混匀，制成富血小板血浆（PRP）。

    1.3  RP测定和标记

    FCM专用试管2支，分别加入15 μL PRP、50 μL PBS和5 μL PECD41单克隆抗体(法国IMMUNOTECH公司)标记血小板，充分混匀，室温避光孵育20 min后，分别加入1 mL PBS和TO试剂（20 mg/L）(Sigma公司)，室温避光孵育30 min，FCM(BEPICS  FOR XL/XLMCL型，Coulter公司)检测。参照MATIC等［6］描述设门策略识别RP。使用FCM测定20 000个PLT，吸收光谱为488 nm，激发光谱为530 nm，对数FSC作为X轴，对数FL2(PECD41)作Y轴，设CD41阳性细胞为A门，然后对A门里的PLT继续分析，另开一窗用对数SSC作X轴，对数FL1（ReticCOUNT）作Y轴，沿血小板实际点图上缘设立界值，使自身对照TO阳性的PLT在1%以下。同一标尺测定经TO染色的测定管的TO阳性的PLT，结果以百分比（RP%）表示。以RP%与PLT的乘积作为RP。

    1.4  统计学处理

    结果用±s表示，数据处理应用SPSS 11.0软件，多组数据间比较采用方差分析，两组数据间比较采用t检验。相关分析采用直线相关分析。

    2  结    果

    2.1  AL组与对照组RP、PLT计数比较

    AL组、初治组、复发难治组病人RP、PLT计数低于正常对照组，差异有显著性(F=7.320、6.950，q=4.318～5.897，P<0.05)。见表1。表1  AL病人RP、PLT计数与正常对照组比较，F=7.320、6.950，*q=4.318～5.897，P<0.05

    2.2  AL缓解组与未缓解组化疗前后RP、PLT计数比较

    AL缓解组化疗前RP计数高于化疗后，差异有显著意义（t=2.806，P<0.05）；未缓解组化疗前RP计数低于化疗后，差异有显著性（t=3.128，P<0.05）。见表2。表2  缓解组与未缓解组化疗前后RP、PLT计数比较(ccell／109·L-1，±s)化疗前后比较，*t=2.806、3.128，P<0.05

    2.3  7例AL病人化疗过程中RP、RP%、PLT的动态变化

    动态观察7例初治AL病人化疗过程中RP、RP%、PLT变化，骨髓抑制期RP、RP%低于骨髓恢复期（F=7.061、9.345，q=3.932～5.983，P<0.05）。RP%与PLT呈负相关（r=-0.373，P<0.05）。见表3。 表3  7例AL病人化疗过程中RP、RP%、PLT的动态变化与化疗前比较，F=7.061、9.345、12.21，*q=2.541～3.582，P<0.05；与骨髓恢复期比较，＃q=3.932～5.983，P<0.05

    目前，AL常规诊疗根据外周血和骨髓穿刺检查结果，但化疗后血小板动力学变化非常快，目前没有临床实验室指标能够预示化疗后血小板恢复［5］。有学者在对恶性血液病病人化疗后RP计数和平均血小板体积（MPV）的研究中发现，骨髓抑制期RP%为(4.3±1.89)%，而骨髓恢复期所有病人的RP%均大于10.5%，且高于正常对照组的(5.7±2.4)%，差异有显著性［8］。本文结果与其基本一致。对比之下，本文18例病人在骨髓恢复期只有12例MPV是升高的。

    AL病人由于骨髓内恶性克隆的增长对巨核细胞生成和分化产生抑制，出现血小板减少。本文结果显示，AL病人化疗前、化疗结束、骨髓抑制期、恢复期的RP、PLT均降低，而巩固化疗者无论RP、PLT都与正常对照组没有差别，说明化疗后达到缓解的AL病人的骨髓恢复了正常的造血功能。复发难治病人RP低于正常，可能与本组病人的骨髓在复发早期生成血小板的能力就受到肿瘤抑制有关。KIENAST等［1］报道，在AL的不同病理阶段RP可能下降﹑正常和增高，其机制可能与骨髓巨核细胞被肿瘤细胞抑制有关；骨髓巨核细胞数量与RP密切相关，骨髓巨核细胞增加或正常者，RP显著升高；而巨核细胞减低组，RP下降或正常。本文结果显示，缓解组化疗前RP明显高于化疗后，未缓解组化疗前RP低于化疗后，而两组病人PLT化疗前后均无变化，提示AL化疗前后RP的变化可能与治疗结果有关。

    本文动态观察结果显示，7例初治AL病人RP、RP%与PLT在化疗后的变化趋势是一致的，但骨髓抑制期和骨髓恢复期PLT没有明显差异，而骨髓抑制期无论RP%还是RP均低于骨髓恢复期。提示RP计数完全可以代替PLT来监测骨髓造血功能的早期恢复。

    STOHLAWETZ等［9］用FCM动态检测了7例经过强烈化疗后AML病人外周血PLT和RP%，发现RP%的显著升高发生在化疗开始后第17～24天，平均20 d，随后在1～3 d内外周血PLT才升高，平均2 d，认为骨髓恢复期RP的升高可以代表外周血小板计数的重建并可以减少或排除预防性血小板的输注。而川合阳子［10］在对AML化疗后恢复期的PLT和RP的连续观察中发现，多数病例RP增高比血小板增高早出现4～5 d，提示RP水平是恶性血液病化疗后骨髓恢复的一个早期指标。

    本文对RP、RP%、PLT的相关性研究显示，RP%与PLT呈负相关，认为外周血PLT数目的增加与骨髓释放RP增多进而成熟有关，在血小板计数上升之前，首先出现RP比例增高，随着RP的成熟，以后释放的RP由于成熟PLT增加而被稀释，其RP%下降。

    综上所述，通过对AL病人RP的检测及动态观察，可以准确了解病人所处的疾病状态和骨髓造血功能的恢复情况，预测血小板恢复时间以指导临床治疗。

【参考文献】
  ［1］KIENAST J, SCHMITZ G. Flow cytometric analysis of thiazole orange uptake by platelets:a diagnostic aid in the evaluation of thrombocytopenic patients［J］. Blood, 1990,75:116.

［2］RINDER H M, TRACEY J B, RECHT M, et al. Differences in platelet αgranule release between normals and immune thrombocytopenic patients and between young and old platelets［J］. Thromb Haemost, 1998,80:457.

［3］RICHARDS E M, JESTICE H K, MADENDRA P, et al. Measurement of reticulated platelets following peripheral blood progenitor cell and bone marrow transplantation: implications for marrow reconstitution and the use of thrombopoietin ［J］. Bone Marrow Transplantation,1996,17:1029.

［4］STIEGLAR G, STOHLAWETZ P, PECK R M, et al. Direct evidence for an increase in thrombopoiesis after liver transplantation［J］. Eur J Clin Invest, 1998,28 (9):755.

［5］CHAO W, BRIAN R S, KENNETH A, et al. Reticulated platelet predict platelet count recovery following chemotherapy［J］. Transfusion, 2002,42:368.

［6］MATICH G B, CHAPMAN E S, ZZISS M, et al. Whole blood analysis of reticulated platelet:improvements of detection and assay stability ［J］. Cytometry, 1998，34:229.

［7］PETEREC S M, BRENNAN S A, RINDER H M, et al. Reticulated platelet values in normal and thrombocytopenic neonates［J］. J Prdiatr, 1996,129:269.

［8］陈军浩，欧阳健，夏永泉. 网织血小板在血小板减少性疾病及造血干细胞移植中的意义［J］. 流式细胞仪, 2001,12：45.

［9］STOHLAWETZ P, STIEGER G. The rise of reticulated platelets after intensive chemotherapy for AML reduces the needs for platelet transfusions［J］. Ann Hematol, 1998,78:271.

［10］川合阳子.网血小板の检出とモの意义［J］. 临床检查，1995，91:445.

作者单位：（1 青岛市海慈医院内分泌科，山东 青岛 266033； 2 青岛大学医学院附属医院血液内科； 3 青岛大学医学院附属医院检验科； 4 青岛大学医学院附属医院肿瘤科; 5 胶南市人民医院医务科）