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【摘要】 目的 探讨热休克蛋白70 (HSP70) 对离体大鼠供心的保护作用，观察其对供心心肌细胞功能及超微结构的影响。方法 Wistar 大鼠18只,随机分为2组:对照组腹腔注射生理盐水0.5 mL，24 h后取心脏灌注HTK心脏保护液,4 ℃保存3 h后建立Langendorff离体心脏灌注模型,灌注KH液2 h；实验组腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1 μmol/kg (0.53 mg/kg)，24 h后取心脏,处理方法同对照组。测定两组心肌肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率以及心肌水含量（MWC）、HSP70、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的水平。观察心肌细胞光镜结构和电镜下的超微结构。结果 实验组HSP70、SOD的含量较对照组明显增高(t=17.96，P<0.01) ；实验组MWC、MDA含量、CK、LDH漏出率较对照组明显降低（t=4.13～15.81，P<0.01）。实验组心肌细胞光镜下以及电镜下超微结构的损伤程度较对照组明显减轻。结论 心肌HSP70高表达对离体大鼠供心心肌细胞具有明显的保护效应。
【关键词】 热休克蛋白70 心室 超氧化物歧化酶 丙二醛 大鼠
PROTECTIVE EFFECTS OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 ON MYOCARDIAL CELL OF ISOLATED RAT HEART CHI YIFAN, SHENG WEI, SUN ZHONGDONG, et al(Department of Cardiovascular Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the protective effects of heat shock protein 70 on myocardial cell function and ultrastructure of isolated rat heart.MethodsWistar rats (n=18) were randomly divided into two groups. In the control group (n=9), normal saline 0.5 mL, while in the experimental group (n=9), noradrenaline bitartrate 3.1 μmol/kg (0.53 mg/kg) instead, were injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored at 4 ℃ for three hours in Histidinetryptophanketoglutarate (HTK) solutions. The isolated hearts were then perfused for two hours by Langendorff model. Myocardial HSP70, SOD, MDA content,myocardial water content (MWC) and lactate dehydrogenase (LDH) and creatinekinase (CK) leakage were detected, the light and electron microscope structure were observed.ResultsHSP70 in experimental group were higher than that in control group (t=17.96,P<0.01) and the biochemical indicators in experimental group were better than that in control group （t=4.13-15.81,P<0.01）. There were alleviated ultrastructure injures in experimental group as compared with that in control group.ConclusionMyocardial HSP70 might be effective in protection of myocardial cells of rat donor heart.
［KEY WORDS］heat shock protein 70; ventricle; superoxide dismutase; malondialdehyde; rats
热休克蛋白(HSP)能对抗严重的应激损伤。研究显示，高温、低氧、再灌注、局部损伤或感染等多种有害因素刺激均可产生热休克蛋白[1]。HSP70 是HSP中最保守、最主要、含量最丰富的一类。心脏移植过程难免要经历缺血再灌注及低温保存带来的损伤。因此，供心保护一直受到关注。本实验的目的是通过腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素诱导供心心肌HSP70高表达，观察其对供心心肌细胞结构及功能的影响，探讨HSP70对离体大鼠供心心肌细胞的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
雄性Wistar大鼠18只,体质量250～350 g,由青岛市药检所动物中心提供,随机分为对照组和实验组，每组9只。
1.2 实验方法
对照组腹腔注射生理盐水0.5 mL,注射后24 h取心脏,灌注HTK心脏保护液,储存于4 ℃保存液中3 h,建立Langendorff离体心脏灌注模型，然后灌注KH液2 h；实验组腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1 μmol/kg(0.53 mg/kg)，24 h后取心脏,余处理步骤同对照组。心脏灌流结束后取左心室心肌组织待测。
1.3 测定指标
1.3.1 心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）漏出率测定 复灌后10 min,留取冠状动脉流出液,置于-20 ℃冰箱中保存,以备测定心肌酶漏出量。全自动生化分析仪测定CK、LDH浓度。按下式计算心肌CK和LDH的漏出率。CK(LDH)漏出率=CK(LDH)浓度×10 min 漏出液/（1 000×心肌湿质量）。
1.3.2 心肌含水量（MWC）测定 实验结束后在固定部位取心室肌约100 mg，先用滤纸吸干心肌表面水分，使用电子天平称心肌湿质量。然后将心肌置入100 ℃恒温烤箱烘烤5 h，待质量恒定后称干质量，按下列公式计算心肌含水量。心肌含水量（χ%）=心肌湿质量-心肌干质量/心肌湿质量×100%。
1.3.3 心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量测定 实验结束后在同一部位取心肌组织约200 mg，吸干水渍后置入液氮保存。测定前称质量，剪取适量心肌组织块,研磨成100 g/L匀浆,低温离心,取上清液,测定上清液中SOD、MDA 含量。SOD测定采用羟胺法，MDA测定采用TBA法。按试剂盒说明书进行操作。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3.4 心肌组织HSP70含量的检测 实验结束后在同一部位取左室心肌组织，100 g/L甲醛液固定，制备石蜡切片。免疫组化染色严格按照说明书进行（采用SP法，试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。HSP70单抗由Santa Cruz公司提供；免疫组织化学染色试剂盒：SP9001/9002 HistostainTMPlus Kits，由ZYMED公司提供）。HSP70表达位于心肌细胞的细胞质,DAB染色棕色颗粒为阳性产物。光镜观察后应用MPIAS1000型多媒体彩色病理图像分析系统进行图像分析, 并自动测量染色阳性面积。每张切片随机选10个视野(400倍), 以染色阳性面积占视野面积的百分比的均值作为HSP70的表达量。
1.3.5 心肌结构的观察 每组选取石蜡切片行苏木精伊红（HE）染色，光镜下观察；左心室心肌同一部位每组随机选取2例取材，切取1 mm3全层心肌组织块,缓冲液冲洗后置于25 g/L的戊二醛固定液中固定, 继之用10 g/L锇酸固定液作后固定2 h，PBS冲洗,常规乙醇丙酮系列脱水,Epon 812环氧树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,最后置透射电镜下观察并拍照。
1.4 统计学方法
数据以±s表示,使用SPSS 13.0统计软件进行t检验。
2 结 果
2.1 两组心肌HSP70的含量
实验组HSP70含量为（17.78±1.82）%，对照组HSP70含量为（5.22±1.05）%，两组比较差异有显著性(t=17.96,P<0.01)。
2.2 两组心肌部分生化指标比较
实验组LDH和CK漏出率及MWC、MDA含量较对照组明显降低(t=4.13～15.81,P<0.01)；而SOD水平则比对照组明显增高(t=10.89,P<0.01)。见表1。表1 两组心肌组织部分生化指标测定结果
2.3 两组心肌组织光镜观察
实验组心肌细胞形态基本正常，心肌细胞水肿较轻。对照组心肌细胞心内膜水肿，部分区域心肌纤维断裂，心肌局灶坏死(图1、2)。
2.4 两组心肌超微结构观察
实验组心肌细胞膜、核膜保存基本完整；肌丝排
图1 实验组心肌光镜观察结果 HE染色×400 图2 对照组心肌光镜观察结果 HE染色×400 图3 实验组心肌电镜超微结构观察结果 ×15 000 图4 对照组心肌电镜超微结构观察结果 ×15 000
列整齐,密度均匀；肌浆网扩张不明显；线粒体形态基本正常,偶有轻度肿胀,嵴排列整齐，糖原颗粒较对照组明显增多。对照组心肌细胞膜多点断裂，细胞核有边集现象；肌丝稀疏,部分溶解,局部肌丝排列紊乱；肌浆网扩张，线粒体肿胀,部分嵴呈空泡状,少量溶解，糖原明显减少(图3、4)。
3 讨 论
热休克蛋白又称应激蛋白，参与细胞的损伤与修复。HSP70 是一族最保守和最重要的热休克蛋白家族。HSP70 在应激后生成最为显著, 它作为分子伴侣参与细胞内蛋白质的折叠、装配,维持某些肽链的伸展状态,以利其跨膜转位，在线粒体、内质网等不同的区域内发挥作用。其在细胞的信息传递、生长、分化中具有重要的调控作用。同时，它又可以促进某些变性蛋白质的降解清除，重新激活某些酶的活性，维持细胞的正常生理功能，作为一种内源性保护物质对脏器损伤产生保护作用[2]。目前国内外已有许多实验证明，HSP70在心肌缺血再灌注损伤中发挥了保护作用，但对HSP70在供心的保护作用方面未见报道，本实验通过去甲肾上腺素诱导供心心肌HSP70高表达，研究其对离体大鼠供心心肌细胞的保护作用。
SOD是体内重要的氧自由基清除剂之一，它广泛存在于需氧代谢的细胞中，能迅速有效地清除超氧化物阴离子（O-2），是机体抗自由基损伤的重要防御机制。体内活性氧的增多或减少常与体内SOD的含量和活性有关。正常情况下机体内有自由基产生，它之所以未对机体产生损害，是因为机体内同时存在清除自由基的酶系统，SOD就是其中主要者之一。如果生成与清除自由基两者失去平衡，过多的自由基将引起细胞膜上不饱和脂肪酸过氧化而产生过氧化脂质，导致细胞膜的结构和功能的广泛损害[3]。因此，SOD活力的变化可直接影响到组织中的氧自由基浓度。因而SOD水平可以间接反映心肌抗氧化损伤的能力。MDA是心肌缺血时组织内氧自由基对脂质膜氧化后最重要的代谢产物，能较好地反映脂质过氧化程度[4]。因此，MDA也可间接反映缺血再灌注组织内产生的氧自由基水平，也是细胞自由基损伤的指标之一。心脏移植是终末期心脏病确定的治疗手段,供心保护效果在很大程度上决定了移植的成功与否,并对移植后的远期疗效也具有重要影响。心脏移植过程要经历常温缺血、低温保存、以及缺血后的再灌注。目前理论研究和临床实践都证实了心肌缺血再灌注损伤的存在,而对于心肌再灌注损伤的发生机制，国内外大多数学者都认为与下面3个环节有关：①钙超载；②氧自由基的产生；③微血管损伤和白细胞的作用[5]。本实验模拟心脏移植过程，将离体供心经过3 h的低温保存（两组均采用HTK液作为心肌保护液）后进行再灌注，结果表明，与对照组比较, 实验组在再灌注期间,LDH、CK的漏出率及MWC、MDA含量减少, SOD活性、HSP70的含量明显高于对照组。实验组心肌结构明显好于对照组。实验组心肌细胞膜、线粒体结构保存基本完整，心肌线粒体得到良好的保护。推测HSP70的高表达发挥了抗氧自由基损伤的作用，从而减轻了心肌缺血再灌注损伤，保护了心肌细胞结构及亚细胞结构尤其是线粒体免受氧自由基的破坏，从而稳定了细胞膜，防止能量耗竭，这可能是HSP70发挥供心保护作用的机制之一。
总之，该实验充分说明了HSP70在心脏移植过程中对供心心肌缺血再灌注及低温保存期间的保护作用。通过各种方法诱导心肌HSP70高表达，改善供心心肌保存质量，可为临床上心脏移植的开展提供一种可能的方法。
【参考文献】
[1]MORIMOTO R, SARGE D, ABRAVYA K. Transcriptional regulation of heat shock genes: a paradigm for inducible genomic response[J]. Biol Chem, 1992,267(31):2198721990.
[2]GUSAROVA V, CAPLAN A J,BRODSKY J L, et al. A poprotein B degradation is promoted by the molecular chaperones HSP90 and HSP70[J]. Biol Chem, 2001,276:2489124892.
[3]吕向光,王倩,刘涛. 老年性聋病人血浆SOD及MDA含量的检测[J]. 齐鲁医学杂志, 2001,16(3)：202203.
[4]陈文一. 外源性内皮素1对原代培养新生大鼠心肌细胞的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(4)：424427.
[5]梅运清,龙村. HTK器官保存液对供心保护的研究进展[J]. 医学综述, 2001,7(12)：721722.
作者单位：青岛大学医学院附属青岛市市立医院心脏外科，山东 青岛 266071