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首页医源资料库在线期刊齐鲁医学杂志2007年第22卷第4期

外源性雌孕激素对人子宫内膜异位症裸鼠模型早期病灶中MMP1和TIMP1表达的影响

来源:《齐鲁医学杂志》
摘要:【摘要】目的通过建立裸鼠人子宫内膜异位症模型,探讨雌激素、孕激素对子宫内膜异位症早期病灶中基质金属蛋白酶1(MMP1)及其抑制剂(TIMP1)表达的影响。方法将育龄妇女的分泌晚期子宫内膜组织种植入裸鼠的盆腹腔,建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,随机将裸鼠分为4组:雌激素组、孕激素组、雌孕激素联合组(n......

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【摘要】  目的 通过建立裸鼠人子宫内膜异位症模型,探讨雌激素、孕激素对子宫内膜异位症早期病灶中基质金属蛋白酶1(MMP1)及其抑制剂(TIMP1)表达的影响。方法 将育龄妇女的分泌晚期子宫内膜组织种植入裸鼠的盆腹腔,建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,随机将裸鼠分为4组:雌激素组、孕激素组、雌孕激素联合组(n=12)和对照组(n=8),分别肌肉注射雌激素、孕激素和雌孕激素,对照组肌注注射用水。在饲养15 d后处死裸鼠,取异位病灶组织,采用免疫组织化学方法(SP法)检测早期子宫内膜病灶中MMP1和TIMP1的表达。结果 与对照组相比,雌激素组、雌孕激素联合组、孕激素组的MMP1表达均明显增高, TIMP1表达均明显减低,差异有显著性(F=11.134、16.758,q=3.52~4.60,P <0.01);孕激素组MMP1表达明显强于雌激素组,TIMP1表达明显弱于雌激素组(q=3.52、4.57,P<0.05);雌孕激素联合组与孕激素组相比MMP1、TIMP1表达无明显差异(P>0.05)。结论 雌激素、孕激素均能加强异位病灶MMP1的合成,抑制TIMP1的产生,其促进子宫内膜异位症的作用机制可能与此有关。

【关键词】  子宫内膜异位症 裸鼠 雌激素 孕激素 基质金属蛋白酶

    EFFECTS OF EXOGENEOUS ESTROGEN/PROGESTIN ON THE EXPRESSIONS OF MMP1/TIMP1 IN ENDOMETRIOSIS OF NUDE MOUSEJIANG HUA, LOU YANHUI, GUO XINHUA(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo observe the effect of exogenous estrogen and progestin on expression of MMP1 and TIMP1 in the endometriosis (EMs) of nude mouse. MethodsAn animal model of endometriosis was established through implanting the human endometrium of later secretory phase into the abdompelvic cavity of nude mice. The experimental animals were randomly divided into four groups: group Ⅰ treated with daily intramuscular injection of estrogen, group Ⅱ with progestin, group Ⅲ with the combination of estrogen and progestin, and group Ⅳ with normal saline. Fifteen days after injection, tissues of EMs were made into sections and further processed by immunohistochemistry to detect the expression of MMP1 and TIMP1. ResultsWhen compared with group Ⅳ, expressions of MMP1 in groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ significantly increased, while expression of TIMP1 significantly decreased (F=11.134,16.758;q=3.52-4.60;P<0.01). Furthermore, the expression of MMP1 in group Ⅱ was significantly stronger than that of the group Ⅰ, and the expression of TIMP1 significantly weaker (q=3.52,4.57;P<0.05). No significant differences in the expressions of MMP1 and TIMP1 could be observed when comparison was made between the group Ⅱ and Group Ⅲ (P>0.05). ConclusionBoth strogen and the progestin can enhance the production of MMP1 and suppress the production of TIMP1, which may related to the mechanism of endometriosis.

    [KEY WORDS]endometriosis; nude mouse; estrogen; progestin; matrix metalloproteinase

    子宫内膜异位症(EMs)表现为有功能的子宫内膜的腺体和基质在子宫腔外生长,其原因可能是子宫内膜通过经血逆流转移和种植所致[1]。基质金属蛋白酶(MMPs)能降解细胞外基质,可能与异位子宫内膜的黏附、种植有关,参与子宫内膜异位症的发生[2~4]。而金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs) 作为MMPs的天然抑制剂,可直接参与细胞外基质(ECM)代谢的调节[5]。本研究通过建立裸鼠子宫内膜异位症模型,研究雌孕激素对子宫内膜异位症病灶中MMP1及其抑制剂TIMP1的影响和调节,以期了解雌孕激素在子宫内膜异位症发病机制中所起的作用。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组

    由北京实验动物中心提供雌性裸鼠56只,周龄4~6周,体质量18~24 g,平均(20.10±3.21) g,SPF级条件饲养。随机分为雌激素组(B组)、孕激素组(C组)、雌孕激素联合组(D组),每组12只;对照组(A组),8只。

    1.2  标本取样及处理

    人子宫内膜取自16例子宫内膜异位症病人,病人年龄35~43岁,平均39.26岁。经刮宫或开腹手术刮取分泌晚期子宫内膜,用PBS缓冲液漂洗,剪成约0.2~0.3 cm3大小的碎块,置入PBS缓冲液中(其中含有青霉素200 kU/L、链霉素200 kU/L)。30 min内种植于裸鼠盆腹腔内。

    1.3  标本种植及激素应用方法[6]

    采用5 g/L戊巴比妥给裸鼠做腹腔麻醉,剂量为15~18 mL/kg。将麻醉后裸鼠固定、剖腹,切口长约2 cm。将子宫内膜碎块分别植入裸鼠盆腹腔不同部位,每只裸鼠种植8~10块。种植后缝合切口,肌注青霉素、链霉素3 d预防感染。自种植当日起雌激素组给予苯甲酸雌二醇200 μg/kg,孕激素组给予黄体酮25 mg/kg,雌孕激素联合组给予苯甲酸雌二醇200 μg/kg+黄体酮25 mg/kg,对照组给予注射用水0.25 mL,均肌肉注射,每3 d注1次。

    1.4  取材方法

    除雌激素组和雌孕激素联合组因感染和手术操作误伤等原因各死亡1只裸鼠,其余54只饲养15 d后全部脱颈椎处死,剖腹,观察盆腹腔移植内膜块生长情况。同时取异位病灶54份,用40 g/L中性甲醛溶液固定,石蜡包埋,4 μm 厚连续切片,苏木精伊红染色后显微镜下观察到典型子宫内膜组织者为入选标本。

    1.5  MMP1和TIMP1测定

    采用免疫组化SP法。一抗及SP 试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司,二抗为MMP1和TIMP1兔抗人单克隆抗体。按试剂盒说明书要求操作。结果采用澳大利亚Wei Niyand公司生产的彩色图像分析仪病理图文分析系统分析。以细胞内有棕黄色颗粒者为阳性细胞,分别计算阳性细胞的扫描面积,以平均灰度(总灰度/扫描面积)代表MMP1和TIMP1的表达强度。每个切片选择4个视野,每个视野测定3次后取均值。由同一人用同一台仪器测定。

    1.6  统计学处理 

    采用SPSS 10.0软件包进行数据处理,数据间比较采用方差分析。

    2  结    果

    2.1  子宫内膜种植生长情况

    2.1.1  肉眼观察  人子宫内膜置入裸鼠盆腹腔后,种植成功率100%。种植部位以腹壁、膀胱旁脂肪、肠管表面、大网膜和肠系膜为主,少数种植部位为腹壁切口、肝表面、脾周脂肪。移植内膜与裸鼠组织呈融合状态,不易剥离,盆腹腔组织多处粘连。雌激素组移植内膜与裸鼠组织牢固黏连,隆起明显,质地稍硬,盆腹腔组织粘连明显,病灶大多为白色和红色。雌孕激素联合组比雌激素组病灶显著增大,颜色为深红色者居多,盆腹腔组织粘连严重。孕激素组病灶最大,颜色大多为紫黑色结节,盆腹腔粘连最严重。对照组植入的内膜组织部分粘连,部分游离,并逐渐萎缩吸收,病灶与其他组相比普遍较小,腹腔内粘连程度较轻。

    2.1.2  光镜观察  光镜下观察,所有标本均可见明显的人子宫内膜上皮腺体细胞及间质。

    2.2  MMP1和TIMP1的表达

    MMP1主要表达于腺上皮细胞质,少量表达于间质细胞浆;TIMP1表达于腺上皮细胞质和间质细胞浆。与对照组相比,雌激素组、雌孕激素联合组、孕激素组的MMP1表达均明显增高, TIMP1表达明显减低,差异有显著性(F=11.134、16.758,q=3.52~4.60,P<0.01);孕激素组MMP1表达明显强于雌激素组,TIMP1表达明显弱于雌激素组,差异有显著性(q=3.52、4.57,P<0.05);雌孕激素联合组与孕激素组相比MMP1、TIMP1表达无明显差异(P>0.05)。见表1。表1  各组裸鼠子宫内膜异位症病灶组织MMP1和TIMP1表达比较

    3  讨    论

    3.1  雌孕激素在裸鼠人子宫内膜异位症模型中的作用

    裸鼠是T淋巴细胞功能缺陷动物,具有无胸腺和全身毛发生长发育异常两个主要缺陷特征,细胞免疫力低下,但B细胞功能基本正常,NK细胞活性较高。将人体组织植入裸鼠后,一般可保留其组织学、遗传学以及生物化学特性,并且对各种药物的敏感性不发生改变[7],因此裸鼠是较理想的研究人子宫内膜异位症的模型动物。本实验中将人子宫内膜组织移植入裸鼠体内,其种植物形态与人类子宫内膜异位病灶形态极其相似,进一步证明了这个观点。

    通过建立裸鼠模型研究子宫内膜异位症是当前的研究热点,建立模型的方法多种多样,本研究将人子宫内膜碎块通过外科手术的方式注入裸鼠腹腔,成功建立人子宫内膜异位症模型,在光镜下见内膜上皮细胞以及间质生长,有腺体和分泌活动,其种植成功率达到100%。提示用人子宫内膜碎块通过外科手术方式建立子宫内膜异位症模型成功率高,模型性状显著,值得推广。本文结果显示,在给予外源性雌激素和孕激素后,异位病灶长势明显好于对照组,说明雌孕激素有促进形成子宫内膜异位症的作用。因此,在建立人子宫内膜异位症裸鼠模型的过程中添加雌激素、孕激素均能增加模型的成功率。

    3.2  雌孕激素对MMP1和TIMP1的影响

    子宫内膜细胞随经血逆流种植目前是子宫内膜异位症发病的主导学说,异位内膜的种植、生长需要突破ECM,ECM降解和重建是子宫内膜异位症发病的关键环节。MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶,是ECM降解的主要蛋白水解酶,能水解细胞外基质的多种成分,其中MMP1是MMPs家族中的重要成员,为间质胶原酶,降解底物为Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ型胶原,并且能促进血管内皮细胞生长、导致新生血管的形成,在子宫内膜的异位黏附、种植、生长中起重要作用[8]。 TIMP1是一种可溶性分泌蛋白,可与活化的MMP1形成1∶1的复合物而抑制MMP1降解ECM的蛋白水解活性[9]。人体内卵巢分泌雌孕激素的变化常常影响着子宫内膜异位症病灶局部的MMP1和TIMP1的含量[10]。子宫内膜异位症是性激素依赖性疾病,雌激素、孕激素在子宫内膜异位症的发生发展过程中起着重要的作用。研究发现,在月经周期的各个阶段,随着卵巢雌孕激素含量的变化子宫内膜MMP1和TIMP1的表达量也发生着周期性的变化[11]。临床上也常显示,子宫肌瘤并发子宫内膜异位症病人手术或自然闭经常使以往的子宫内膜异位症的症状改善。

    本文结果显示,雌激素组子宫内膜异位症病灶中的MMP1与对照组相比明显增高,TIMP1明显降低。提示在盆腔子宫内膜异位症的发病过程中, MMP1 的表达异常增高可能是内膜具有侵入性的重要因素;在子宫内膜异位症病灶形成早期,雌激素可以通过增加局部异位内膜MMP1含量,发挥对子宫内膜异位症的促进作用。同时,雌孕激素联合组以及孕激素组MMP1表达含量较雌激素组进一步增高,TIMP1则明显降低,与人体子宫内膜分泌期孕激素增高条件下MMP1值升高、TIMP1值降低相符[12],说明孕激素在异位内膜早期病灶中对MMP1含量能起到进一步促进作用,能加强早期异位病灶中ECM的降解,促进异位病灶的种植及生长。本文结果亦显示,雌孕激素联合组与孕激素组MMP1表达相近且明显强于雌激素组,TIMP1表达相近且明显低于雌激素组。HAMPTON等[13]通过动物实验研究也表明,切除卵巢后的羊子宫内膜组织中TIMP1 mRNA 表达量较高,而雌激素可以使TIMP1的mRNA的表达降低,若同时存在孕激素则TIMP1 mRNA的表达大幅度降至更低的程度,提示在异位内膜中雌孕激素对MMP1和TIMP1作用是以孕激素为主导的。本文研究结果与其相一致。有研究表明,在体外培养子宫内膜间质细胞中添加孕激素后MMP1降低、TIMP1升高,说明孕激素在体外可以抑制培养的异位内膜分泌MMP1[14],这与本文的结果不同,可能与异位内膜进入腹腔内环境后,局部病灶炎性内环境的复杂变化导致MMP1和TIMP1对孕激素的反应不同有关。这也可能是临床上孕激素治疗子宫内膜异位症效果不理想的主要原因。

    子宫内膜异位症早期病灶中由于局部内环境改变,调控表达机制的复杂变化,导致局部MMP1和TIMP1对雌激素、孕激素的反应与体外实验有很大不同,其机制有待于进一步研究。本实验仅研究子宫内膜异位症裸鼠模型早期异位病灶在雌、孕激素影响下的MMP1和TIMP1的变化,至于随着异位病灶的生长,其发展和改变有待于进一步研究。

 

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作者单位:青岛大学医学院附属医院妇科,山东 青岛 266003

作者: 姜华 娄艳辉 郭新华 2008-5-29
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