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【摘要】 目的 观察转化生长因子β1(TGFβ1)对体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy 926屏障功能的影响并探讨其作用机制。方法 体外培养EA.hy 926脐静脉内皮细胞株,实验分为两组,对照组培养液中加入PBS;TGFβ1处理组培养液中添加0.01 mg/L的TGFβ1。将细胞在多聚脂滤膜上培养,测量细胞跨上皮电阻(TER)的变化。免疫荧光检测两组血管内皮钙黏蛋白(VEcadherin)、α连环蛋白、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和纤维连接蛋白的表达变化;RTPCR检测两组VEcadherin和VEGF表达的变化。 结果 TGFβ1处理后TER降低,两组处理前后TER差值比较有统计学意义(t=3.294,P<0.01);TGFβ1处理组VEcadherin和α连环蛋白表达减少,内皮细胞黏附连接被破坏;而VEGF和纤维连接蛋白表达增多,基底膜增厚。结论 TGFβ1可引起内皮细胞屏障功能的破坏,其机制可能与VEGF的表达上调有关。
【关键词】 转化生长因子β 内皮细胞 血管内皮细胞生长因子
THE INFLUENCE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR β1 ON BARRIER FUNCTION OF ENDOTHELIAL CELLSZHANG JINGJING, LIU TING, WANG YIQIANG,et al(Ophthalmological College of Qingdao University, Qingdao 266071, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo observe the influence of transforming growth factor β1(TGFβ1) on barrier function of invitro human umbilical vein endothelial cell line EA.hy 926 and to explore its mechanism of action.MethodsIn vitro cultivated EA.hy 926 cells were divided into control group and TGFβ1treatment group. The control group was incubated with PBS, and TGFβ1treatment group with 0.01 mg/L TGFβ1. EA. hy 926 cells were cultured on polyester microporous filters and the transepithelial resistance (TER) was recorded after TGFβ1 treatment. The expression of VEcadherin,αcatenin, VEGF and fibronectin were examined with immunofluorescence staining, and the expression of VEcadherin and VEGF in mRNA levels were detected with reverse transcriptasepolymerase chain reaction.ResultsIn TGFβ1treatment group, TER decreased, and difference of TER before and after treatment in two groups was statistically significant (t=3.294,P<0.01); expression of VEcadherin and αcatenin decreased, adherent junctions of endothelial cells were destructed, while the expression of VEGF and fibronectin increased, basement membrane became thicken.ConclusionTGFβ1 can destroy barrier function of endothelial cells, which may be related to upregulative expression of VEGF.
[KEY WORDS]transforming growth factor β; endothelial cell; vascular endothelial growth factor
TGFβ是一种促进细胞转型和纤维化发展的生长因子,组织的低氧可以导致TGFβ激活[1],从而提高内皮细胞的通透性[2],但其具体机制尚不明确。本实验通过体外培养的EA.hy 926脐静脉内皮细胞株,观察TGFβ1对内皮细胞屏障功能的影响,以探讨TGFβ1提高血管内皮细胞通透性的作用机制。 现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
EA.hy 926细胞来自CoraJean S. Edgell,The University of North Carolina at Chapel Hill and the Tissue Culture Facility的惠赠,胎牛血清购自美国Gibco公司,小鼠抗人血管内皮细胞钙黏蛋白IgG2B 购自美国Rndsystems,小鼠抗人α连环蛋白IgG1、兔抗人VEGF IgG 、兔抗人纤维连接蛋白IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG抗体和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗兔IgG抗体均购自北京中杉金桥生物有限公司,引物由Invitrogen公司(中国)合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 EA.hy 926细胞置于含0.10胎牛血清的高糖型DMEM培养基上,在37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱内培养。然后以每孔105个细胞接种到24孔培养板,待细胞生长成单层后,随机分为2组,对照组在含体积分数0.02胎牛血清的高糖型DMEM培养基中培养,同时加入磷酸钠缓冲液(PBS);TGFβ1处理组在含体积分数0.02 胎牛血清的高糖型DMEM培养基中培养并加入 0.01 mg/L的TGFβ1。两组均每2~3 d换液一次,细胞培养7 d后进行免疫荧光、RTPCR检测。
1.2.2 跨上皮电阻(TER)测定 将内径10 mm、外径12 mm、底部为0.45 mm孔径多聚酯滤膜的杯状培养皿(美国 Millipore公司)置入24孔板,杯内接种EA.hy 926细胞,其密度为1.5×105/cm2,杯内培养液400 μL,杯外培养液600 μL。设立无细胞对照组,用上皮电阻计(EVOM,美国 World Precision Instruments公司提供)每天测量细胞TER,待TER值稳定后,将8个孔的细胞随机分为2组。每2~3 d更换培养液。培养7 d后,全部更换为无TGFβ1的培养液,测量TER,每孔测量6次。TER的实际值计算方法:(每孔测得6次数值的平均值-无细胞对照孔值)×0.6。
1.2.3 免疫荧光染色 将预先经酸洗、浸泡、灭菌盖玻片放入24孔板内进行细胞爬片,细胞分组培养7 d后取出,进行血管内皮钙黏蛋白(VEcadherin)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、α连环蛋白(αcatenin)及纤维连接蛋白(fibronectin)免疫荧光染色,具体步骤参考文献[3]。
1.2.4 RTPCR 消化、收集、洗涤细胞,用RNA总提取试剂盒(德国MN公司)按说明书操作提取总RNA。VEcadherin的引物序列参考文献[4],使用Primer 3软件设计扩增其他所用引物,VEGF上游引物序列为5′GAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG3′,VEGF下游引物序列为5′CTTTGGTCTGCATTCACATTTG3′,PCR产物片段长为400 bp;GAPDH上游引物序列为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,GAPDH下游引物序列为5′TCCACCACCCTGTGGCTGTA3′,PCR产物片段长为439 bp。用逆转录反应试剂盒(Bio Basic Inc)按说明书合成cDNA,然后用RTPCR试剂盒(北京天根公司)按说明书要求进行扩增,具体反应条件参照文献[5],PCR产物在20 g/L凝胶中电泳,用1 g/L溴化乙锭溶液漂洗,洗涤后将凝胶置于Kodak凝胶成像仪系统进行成像处理,并用Image J软件分析结果。
2 结 果
2.1 TER检测
细胞培养至10 d时电阻值达到稳定,对照组的TER为30.80±2.80,TGFβ1处理组的TER为29.45±1.51,细胞培养7 d后,TGFβ1处理组TER为21.00±1.44,对照组为29.15±0.96。两组处理前后TER差值比较,差异有极显著意义(t=3.294,P<0.01)。
2.2 TGFβ1作用后两组VEcadherin、α连环蛋白、VEGF及纤维连接蛋白表达变化
对照组VEcadherin和α连环蛋白主要表达于细胞与细胞连接处,并形成黏附连接(图1a、1b),细胞内有少量VEGF和纤维连接蛋白表达(图1c、1d)。TGFβ1处理组VEcadherin和α连环蛋白在细胞连接处表达明显减少(图2a、2b),而细胞内VEGF和纤维连接蛋白表达明显增多(图2c、2d)。
2.3 TGFβ1对VEcadherin和VEGF转录影响
对照组和TGFβ1处理组VEcadherin、VEGF和内参GAPDH基因转录情况见图3a~3c。VE
图1a 对照组VEcadherin表达于细胞与细胞连接处 图1b 对照组α连环蛋白表达于细胞与细胞连接处 图1c 对照组VEGF在细胞浆内有少量表达 图1d 对照组内皮细胞纤维连接蛋白有少量表达 图2a TGFβ1处理组内皮细胞连接处的VEcadherin表达减少 图2b TGFβ1处理组内皮细胞连接处的α连环蛋白表达减少 图2c TGFβ1处理组内皮细胞浆内的VEGF表达减少 图2d TGFβ1处理组内皮细胞纤维连接蛋白表达增多cadherin与内参GAPDH比值,对照组为 0.554±0.023,而TGFβ1处理组为0.343±0.010,VEGF与内参GAPDH的比值,对照组为0.752±0.015,TGFβ1处理组为0.984±0.027。可见TGFβ1处理后VEcadherin转录下调,VEGF基因转录上调。
3 讨 论
国外研究证实,人体内皮细胞屏障是一个离子电荷屏障,在离体条件下通过检测内皮细胞单层融合状态下的TER,能够反映出这一屏障的某些生理学特征[6]。有学者将多种器官来源的微血管内皮的TER进行了比较研究后,提出TER值的大小可以反映各种内皮细胞屏障能力的不同[7],并认为该指标是评估内皮细胞通透能力的灵敏指标。GILLIES 等[8]研究培养了牛视网膜微血管内皮细胞,发现培养的细胞能在体外保持屏障功能。本实验结果显示,TGFβ1可以降低TER,从而破坏内皮细胞的屏障功能。
内皮细胞作为血管内皮基本的结构和功能单位,它的一个重要功能就是发挥其屏障功能,与细胞外基质共同构成完整的内皮细胞屏障。内皮细胞间连接的破坏和基底膜不规则增厚将导致内皮细胞屏障的破坏和血管渗透性增加。内皮细胞间存在多种细胞间连接复合体,包括紧密连接、黏附连接、桥粒和缝隙连接,它们使组织器官与外环境分隔开,保证了内环境的稳定并为细胞间相互作用提供了结构基础,其中黏附连接是由Ca2+依赖的VE钙黏蛋白之间的黏附,以及与VE钙黏蛋白相结合的多种连环蛋白(如α连环蛋白)和肌动蛋白细胞骨架相互作用形成的。一般认为,黏附连接的形成是紧密连接形成的前提,它的形成活化了细胞内多种有活性的蛋白质分子,最终导致紧密连接相关蛋白聚集于相邻细胞接触部位,形成一个完整的顶端连接复合体。本实验显示,TGFβ1可以使VEcadherin和α连环蛋白表达减少,破坏内皮细胞的黏附连接,致细胞连接处的缝隙增加。
TGFβ是一种促进纤维化发展的生长因子,在高血压动脉硬化、小动脉玻璃样变及血管重塑过程发挥着重要作用[9]。TGFβ1与其受体结合后,可以激活TGFβ/Smad信号途径,调节细胞核的转录活动,使VEcadherin转录下调,α连环蛋白表达减少,破坏内皮细胞黏附连接,致使内皮细胞的TER降低和屏障功能破坏。TGFβ1还能增加纤维连接蛋白的表达,导致细胞基底膜增厚,进一步破坏内皮细胞的屏障功能。
VEGF又称血管通透因子,具有增加微血管通透性的作用,引起血浆蛋白的外渗;VEGF可以使VEcadherin内吞增加和细胞连接处的VEcadherin再分配[10,11],破坏细胞的黏附连接,导致内皮细胞屏障功能破坏和血管渗透性增加。本实验显示,TGFβ1可以使VEGF表达增多,这可能是TGFβ1破坏内皮细胞屏障功能的另一条途径。
糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最为常见的眼部并发症,其发病的中心环节是高血糖症及其引起的组织缺血低氧引发的一系列病理改变,早期主要的病理改变为血视网膜内屏障破坏造成视网膜组织水肿(尤其是黄斑水肿)、渗出、出血等,这可能与DR病人血浆内TGFβ1增多有关[12]。TGFβ1使VEGF表达增多,导致内皮细胞基底膜增厚,细胞黏附连接破坏,从而影响血视网膜屏障功能的完整性,造成血管渗透性增加,血液成分渗漏聚集在视网膜内形成视网膜水肿。因此,我们推测TGFβ1介导的内皮细胞屏障功能的破坏,可能在DR发生中起着重要作用。
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作者单位:青岛大学眼科学院,山东 青岛 266071