慢性B淋巴细胞白血病病人骨髓及外周血ZAP70与CD38表达及意义

【摘要】  目的 探讨ZETA相关蛋白(ZAP70)、CD38在慢性B淋巴细胞白血病(BCLL) 病人骨髓及外周血中的表达及两者相关性，并分析其临床意义。 方法 采用半定量RTPCR的方法对19例BCLL病人及12例正常人骨髓或外周血ZAP70 mRNA的表达水平进行测定，采用流式细胞术检测CD38的表达水平。结果 在19例BCLL病人中，7例ZAP70阳性表达，8例CD38阳性表达；对照组ZAP70、CD38均为阴性表达。 结论 ZAP70 mRNA、CD38在BCLL中表达阳性提示预后不良。ZAP70可以取代IgVH基因突变状态作为BCLL有效的预后指标 。

【关键词】  基因 ZAP70 基因 CD38 白血病 淋巴细胞 慢性 基因表达 预后

    EXPRESSIONS OF ZAP70 AND CD38 IN CHRONIC B LYMPHOCYTIC LEUKAEMIA AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCEYU JUNHONG, MENG FANJUN, GUO XIAOFANG（Department of Hematology , The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China） ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expressions of ZAP70 and CD38 in chronic B lymphocytic leukaemia (BCLL) and the correlation between them.MethodsSemiquantitative RTPCR was utilized to analyze ZAP70 expressions in patients with BCLL (n=19) and normal adults (n=12), and CD38 expression was assessed by flow cytometry.ResultsPositive expression of ZAP70 was found only in seven patients with BCLL (7/19) and CD38 in eight patients.ConclusionZAP70 and CD38 expressions predict poor prognosis of chronic lymphocytic leukaemia. ZAP70 may replace IgVH mutational status to be an valid prognostic index of this disease.

    ［KEY WORDS］gene, ZAP70; gene, CD38; leukemia, lymphocytic, chronic; gene expression; prognosis

    慢性淋巴细胞白血病（CLL）是一种主要累及B淋巴细胞的恶性肿瘤，好发于老年人，在西方国家比较常见，在中国及其他亚洲国家较少见，近年来，其发病率有逐渐上升的趋势。CLL临床预后差异极大，部分病人初始进展缓慢甚至终身无需治疗，部分病人发病即呈侵袭性，需要即刻治疗[1，2]。目前认为，免疫球蛋白重链可变区（IgVH）基因有无突变是CLL最重要的预后指标。CD38是CLL细胞的一个信号分子，也可以作为CLL独立的预后指标。最近，ZETA相关蛋白(ZAP70)作为CLL预后的评估指标备受关注[3，4]。本研究旨在探讨ZAP70和CD38的表达及其与BCLL病人预后的关系。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    2004年10月～2006年10月，青岛市各医院血液科诊断和治疗的BCLL病人19例，男15例，女4例；年龄45～69岁，平均56.5岁。多数因贫血、乏力、浅表淋巴结大（以颈部、腋下、腹股沟为主）而就诊。病人就诊时白细胞（WBC）＞10×109/L 7例，血红蛋白（Hb）平均为118 g/L，血小板计数(PLT)平均为125×109/L。淋巴结大13例，伴肝脾大3例。Binet分期：A期11例，B期5例，C期3例。CLL的诊断参照《血液病诊断及疗效标准》。选择12例正常人作为对照组，其中男8例，女4例；年龄45～55岁。

    1.2  材料

    Trizol试剂、RTPCR一步法试剂盒购自QIAGEN公司。

    1.3  方法

    取受检者新鲜骨髓或外周血5 mL，肝素抗凝，分离B淋巴细胞，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度，采用半定量RTPCR法测定ZAP70 mRNA的表达。ZAP70引物为：正义链5′ GACAACCCCTACATCGTGCG3′， 反义链5′ TTGGCCTCTCCAAAGCACTG3′；βactin引物为：正义链5′ACGTCTGCTGGAAGGTGGAC3′，  反义链5′GGTACCACCATGTACCCAGG3′。总反应体系为50 μL，50 ℃反转录30 min后，95℃变性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，阳性结果可见279 bp和163 bp处各有一条亮带，分别为ZAP70和βactin。用光密度扫描仪扫描并取得ZAP70/βactin比值进行半定量分析。三色法流式细胞术测CD38表达水平，设定≥20％ BCLL细胞表达CD38为阳性表达，<20％ BCLL细胞表达CD38为阴性表达。

    2  结    果

    2.1  ZAP70 mRNA表达水平

    19例BCLL病人中7例（36.8％）ZAP70阳性表达，对照组12例均不表达ZAP70，两者比较差异有显著性（χ2=5.71，P<0.05）。ZAP70阳性病人5例（71.4％ ）临床分期为B和C期，2例为A期；而ZAP70阴性病人只有2例（16.7%），临床分期为B、C期。B和C期ZAP70阳性表达明显高于A期（χ2=5.70，P<0.05）。

    2.2  CD38的表达水平

    BCLL病人CD38阳性表达8例，CD38阴性表达11例；而对照组均不表达CD38（χ2=4.07，P<0.05）。CD38阳性病人6例（75％）临床分期在B和C期，2例为A期；而11例CD38阴性病人，只有2例（18.2％）为B期；B和C期CD38阳性表达明显高于A期（χ2=6.13，P<0.05）。

    2.3  ZAP70 mRNA与CD38表达的关系

    在19例BCLL病人中，5例ZAP70阳性并CD38阳性，11例ZAP70阴性并CD38阴性；2例ZAP70阳性并CD38阴性，1例ZAP70阴性并CD38阳性。ZAP70 mRNA和CD38的表达水平呈正相关（r=0.86，P<0.01）。

    3  讨    论

    CLL是一种低度恶性的淋巴细胞疾病，具有显著的临床预后异质性。CLL预后的相关因素较多，包括年龄、疾病分期、外周血淋巴细胞计数、淋巴细胞形态、淋巴细胞倍增时间、骨髓浸润组织学、血清β2MG、LDH、IgVH突变状态、CD38的表达、遗传学异常等。目前认为，IgVH突变状态是BCLL预后可靠的指标。依据IgVH基因有无突变将CLL分为两种亚型：一种为有突变的IgVH基因，起源于记忆B细胞，为生发中心后肿瘤；另一组为无突变的IgVH基因，起源于生发中心前B细胞。HAMBLIN等[5]研究显示，IgVH阴性组细胞形态不典型，临床分期处于晚期，疾病呈进展型，预后不良；而IgVH阳性组临床分期处于早期，病程进展较慢，生存期长，预后良好。有研究同时比较了两组的中位生存期（MS），IgVH阳性组MS为293个月，IgVH阴性组MS为95个月。但是，检测IgVH的变异非常复杂，而且检测昂贵、费时，大多数实验室难以做到，从而限制了其在常规实验室诊断中的应用。

    CD38是CLL细胞的一个信号分子，是与白细胞活化相关的抗原，是能促使B细胞活化和增殖的Ⅱ类跨膜糖蛋白，也可以作为CLL独立的预后指标。本研究中8例CD38阳性病人临床分期大部分在B和C期，对化疗药物反应差；而CD38阴性病人大部分病情进展缓慢，不需要治疗。DEL POETA等[6]分析了168例BCLL病人CD38的表达，结果显示CD38阳性病人无进展生存期较CD38阴性病人明显缩短，病情进展迅速。早期实验证明CLL病人CD38表达与IgVH突变状态相关，提示CD38可能作为IgVH突变状态的替代指标。有实验研究证明IgVH阴性组CD38阳性细胞计数高，而IgVH阳性组CD38计数低，二者呈负相关，但是也有实验证实二者之间缺乏相关性。而且， CD38的表达在CLL病情进展中会发生相应的变化。因此，需要寻找更简便、更可靠的替代标志物。ZAP70是T细胞相关的相对分子质量为70 000的一种 Syk家族蛋白酪氨酸激酶，它表达在正常T细胞和NK细胞中，并在这些细胞的分化和进展中起重要的作用。ZAP70在正常B淋巴细胞不表达，但是在BCLL中表达，且在疾病的发展过程中表达相对稳定[7]。DURING 等[3]将CLL病人分为ZAP70阳性和ZAP70阴性两组，比较各自的中位生存期，前者为139个月，后者＞300个月。ORCHARD等[8]研究显示，ZAP70阴性与ZAP70阳性病人的生存期分别为24.4年与9.3年。本研究19例BCLL病人，ZAP70阳性表达率为36.8％，CD38阳性表达率为42.1%。同时将19例病人分为3组观察其治疗效果，ZAP70阴性CD38阴性组病人病情进展缓慢，症状较轻，临床分期大多在Binet A期，一般无需治疗。ZAP70阳性CD38阳性组病人临床症状重，常有贫血、血小板减少，临床分期在Binet B、C期，常规化疗后，临床症状、体征改善不明显，完全缓解率极低，病情进展迅速。因此，ZAP70、CD38阳性病人比阴性病人病情更具侵袭性，预后更差，需要在早期即给予更强烈的化疗。有研究认为，ZAP70可以代替IgVH基因突变作为BCLL更准确、更敏感的预后指标，但是二者之间关系的机制目前尚未清楚。LAURA[9]分析了307例CLL病人B细胞的ZAP70的表达和IgVH 基因突变的关系，发现164例IgVH基因未突变的病人中表达ZAP70者117例，但是在143例IgVH基因突变的病人中只有24例表达ZAP70。ORCHARD 等[9]研究了167例BCLL病人ZAP70 mRNA表达、IgVH基因突变状态以及临床预后方面是否一致，认为ZAP70可以代替IgVH基因突变作为BCLL的预后指标。

    总之，ZAP70和CD38的表达可以作为BCLL独立的预后指标。而且，ZAP70表达相对CD38表达可能更稳定准确。根据ZAP70及CD38的表达可以指导临床采用合理的治疗策略，从而提高病人无病生存期，显著改善部分病人的预后。

【参考文献】
  [1]DIGHIERO G, BINET J L. When and how to treat chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med, 2000,343(24):17991801.

[2]HAMBLIN T J, DAVIS Z, GARDINER A, et al. Unmutated IgVH gene are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia[J]. Blood, 1999,94:18481854.

[3]DURING J, NUCKEL H, CREMER M, et al. ZAP70 expression is a prognostic factor in chronic lymphocytic leukemia[J]. Leukemia, 2003,17(12):24262434.

[4]CRESPO M, BOSCH F, VILLAMOR N, et al. ZAP70 expression as a surrogate for immunoglobulinvariableregion mutations in chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med, 2003,348(18):17641775.

[5]HAMBLIN T J, DAVIS Z, GARDINER A, et al. Unmutated IgVH gene are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia[J]. Blood, 1999,94:18481854.

[6]DEL POETA G, MAURILLO L, VENDITTI A, et al. Clinical significance of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia[J]. Blood, 2001,98:26332639.

[7]CRESPO M, BOSCH F, VILLAMOR N, et al. ZAP70 expression as a surrogate for immunoglobulinvariableregion mutations in chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med, 2003,348(18):17641775.

[8]ORCHARD J A, IBBOTSON R E, DAVIS Z, et al. ZAP70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukaemia[J]. Lancet, 2004,363:105111.

[9]LAURA Z. ZAP70 compared with immunoglobulin heavychain gene mutation status as a predictor of disease progression in chronic lymphocytic leukemia[J]. N Engl J Med, 2004,351(9):893901.

作者单位：岛大学医学院附属医院血液内科，山东 青岛 266003