对氧磷酶1的192位点基因多态性与颈动脉斑块关系

【摘要】  目的 探讨对氧磷酶1（PON1）基因GluArg 192位点基因多态性与颈动脉斑块的关系。方法 用多聚酶联反应限制片段多态性分析技术（PCRRFLP），对49例颈动脉斑块形成病人及49例正常人PON1的192 位点进行基因分型。结果 颈动脉斑块病人的PON1 QQ、QR、RR基因型的构成比与正常人比较差异无显著性（χ2=1.030,P>0.05）。结论 PON1 的92等位点基因型与颈动脉斑块形成无相关关系。

【关键词】  对氧磷酶1 颈动脉 动脉硬化 等位基因

    Q192R POLYMORPHISM OF THE PARAOXONASEL GENE AND CAROTID PLAQUELIU ZHAOXIA，TAN LAN，JIANG ZEQIANG(Department  of  Neurology, The People’s  Hospital of Muping, Muping 264100, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the relationship between Q192R polymorphism of the paraoxonas1 (PON1) gene and carotid plaque.MethodsPON1 genotype was determined by PCRRFLP in 49 patients with carotid plaque and 49 normal control subjects.ResultsThe genotype distribution of the PON1 polymorphism was not significantly different between the patients and the normal control (χ2 =1.030，P>0.05).Conclusion192 polymorphism of the PON1 gene is not associated with carotid plaque.

    ［KEY WORDS］paraoxonase1； carotid arteries； arteriosclerosis； alleles

    缺血性脑卒中是我国主要致死疾病之一，近年来研究表明，颈动脉粥样硬化是引起脑梗死的重要原因之一[1]。国内近年报道脑梗死病人颈动脉粥样硬化斑块发生率高达72.5%,且以多发斑块、双侧斑块多见［2］。对氧磷酶1（PON1）是一种相对分子质量为4.4万糖蛋白，它紧密结合于高密度脂蛋白（HDL），属于钙离子依赖性的芳香酯酶,在体外能够抑制低密度脂蛋白（LDL）的氧化[3]。PON1基因存在192 位谷氨酸精氨酸（GluArg）和55位亮氨酸蛋氨酸（LeuMet）多态性[4]。国外文献报道，PON1的192 位等位基因与颈动脉斑块无相关关系［5］。国内文献报道，在2型糖尿病病人中二者有相关关系［6］。但对单纯的PON1的192等位基因和颈动脉斑块之间关系尚无报道。本文应用多聚酶联反应限制片段长度多态性(PCRRFLP)技术，探讨动脉硬化性脑梗死病人PON1的192位等位基因与颈动脉斑块形成之间有无相关关系。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料

    颈动脉斑块组病人49例，为2005年9月～2006年3月青岛大学医学院附属脑科医院以缺血性脑血管病收住院病人，住院当天行颈动脉彩超检查，参照华盛顿大学颈动脉粥样硬化的超声分级标准［7］，确定颈动脉斑块形成。不包括心律失常、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的缺血性脑血管病；排除梗死后出血,肝、肾功能障碍,以及自身免疫性疾病、妊娠、半年内曾行降脂治疗者。其中男27例，女22例；年龄43～82岁，平均（62.0±7.5）岁。对照组49例，为同期在青岛大学医学院附属脑科医院门诊查体的健康人。均经过临床检查和（或）影像学检查排除脑血管病,无脑血管病家族史,排除肝、肾疾病,血液病，自身免疫性疾病，妊娠，半年内曾行降脂治疗者。其中男27例，女22例；年龄40～78岁，平均（60.6±7.0）岁。两组的年龄、性别、体质量指数(BMI)比较，差异无显著性。

    1.2  检测方法

    1.2.1  标本收集  所有受试者采清晨空腹肘静脉血5 mL，置EDTA抗凝管中，-20 ℃保存。

    1.2.2  外周血白细胞DNA的提取  采用LOPAREV等［8］介绍的NaI提取法提取周围血白细胞DNA。

    1.2.3  PCR的扩增  根据文献［9］设计引物序列，上游引物为5′TTGAATGATATTGTTGCTGTGGGACCTGAG3′，下游引物为5′CGACCACGCTAAACCCAAATACATCTCCCAG3′。PCR反应体系的总体积为50 μL，内含有：TaqDNA 聚合酶1.25 U，1.5 mmol/L MgCl2 2 μL，0.5 mmol/L上下游引物各2.5 μL，0.2 mmol/L dNTP 4 μL，0.1 μg DNA模板，10×PCR buffer 5 μL，加入双蒸水至50 μL。然后置PCR扩增仪中,扩增程序设置为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次后72 ℃保温7 min，结束反应，扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    1.2.4  扩增产物的酶切与电泳  取10 μL PCR 扩增产物，加5 U限制性内切酶Hinf Ⅰ (New England Biolabs)，2 μL的10 × buffer，加双蒸水至20 μL，37 ℃水浴消化4 h后，取消化产物加2 μL上样buffer终止反应，并加入含溴化乙锭（0.5 mg/L）的30 g/L琼脂糖凝胶板中，在0.5×TBE缓冲液中电泳，40 min后紫外线灯下观察结果。

    1.3  统计学处理

    PON1基因频率采用频率计数法计算，数据间比较采用卡方检验。

    2  结    果

    扩增的PON1的基因片段大小为111 bp（图1），酶切后电泳见图2，QQ型为1条带（111 bp），QR型为3条带（111、77、34 bp），RR型为2条带（77、34 bp）。正常对照组Q等位基因的发生例数为45例，R等位基因发生例数为53例，颈动脉斑块组Q发生例数为40例，R发生例数为58例，颈动脉斑块组Q 、R等位基因的频率分别为0.408、0.592,正常对照组为0.459、0.541，两组比较，Q、R两等位基因差异无显著性（χ2＝0.519，P>0.05）。表1  两组基因型分布的比较（例,n=49）组  别QQQRRR对照组122116斑块形成组82417

    3  讨    论

    人类PON是一种钙离子依赖性糖蛋白，其基因位于第7号染色体短臂7q2122，PON1基因192位点有CAA/CGA转换，即192位的Glu/Arg（谷氨酸/精氨酸）存在多态性，其等位基因分别为Q和R［10］。PON1在血清中主要以HDL为载体，通过与ApoA1紧密结合而发挥作用，即通过抑制LDL的氧化修饰，降低体内OXLDL水平，并破坏已形成的OXLDL中的具有细胞毒性的溶血磷脂，因而起到抗动脉粥样硬化的作用［11］。但PON1保护LDL免受氧化的能力却因其基因型不同而有所差别［12］。许多研究结果显示，PON1基因型为RR型的人群易患动脉粥样硬化性疾病。PON1基因192位点R等位基因是独立的危险因素。

    国外报道正常欧洲白种人PON1基因Q 、R 等位基因的频率为0.71、0.29[13]，台湾正常人群的Q 、R 等位基因频率为0.35、0.65。刘康桐等［14］报道中国汉人正常人群Q 、R 等位基因频率为0.45、0.55。正常上海人的Q 、R 等位基因频率为0.39、0.61［15］。本文颈动脉斑块组Q 、R 等位基因的频率分别为0.408、0.592,正常对照组为0.459、0.541，两组之间PON1的3种基因型分布及两等位基因之间差别无显著性。提示在山东地区PON1的192 R 等位基因与颈动脉斑块形成无密切相关关系。这一结论与国内外的有些报道不一致, 原因可能有以下几种：①人种不同，②地区差别， ③病例数不同或其他原因，确切机制有待今后进一步探讨。

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作者单位：烟台市牟平人民医院内二科， 山东 牟平 264100