大鼠实验性脑缺血耐受模型的建立与评价

【摘要】  目的 建立大鼠大脑中动脉局灶性缺血再灌注及缺血耐受模型，探讨该模型的应用价值。方法 将84只Wistar大鼠随机分成预缺血＋再缺血（IP+MCAO）组：预缺血10 min后分别于再灌注1、3、7、14、21 d后给予 2 h 大脑中动脉阻塞，然后再灌注22 h后处死；假手术＋再缺血（SS+MCAO）组：假手术代替预缺血，在假手术后按前述不同时间点给予2 h大脑中动脉阻塞, 然后再灌注22 h后处死；假手术对照（SS+SS）组：两次均为假手术。模型建立后通过神经功能评分、TTC染色测定脑梗死体积、苏木精伊红染色观察病理改变对模型进行评估。结果 IP+MCAO 组预缺血后3、7 d神经功能评分与SS+MCAO组相比较，差异有显著意义（t=4.025、2.683，P＜0.05）；IP+MCAO组预缺血后1、3、7 d脑梗死体积与SS+MCAO组比较明显减小，差异有显著意义（t=8.940～10.554,P<0.05）。结论 线栓法制备脑缺血耐受模型切实可行，具有一定的应用价值。

【关键词】  脑缺血 再灌注 缺血耐受 缺血预处理

    ESTABLISHMENT AND EVALUATION OF AN EXPERIMENTAL ISCHEMIC TOLERANCE MODELDONG RUIJIAN, ZHAO RENLIANG, SHEN RUOWU (Department of Neurology, The Central Hospital of Zibo, Zibo 255036, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a rat model of ischemic tolerance and study its significance. MethodsEightyfour healthy wistar rats were randomly divided into three groups: ① Ischemic preconditioning and MCAO group (IP+MCAO),  the rats were given 10 minutes’  focal ischemic preconditioning, and 1,3,7,14, and 21 days later, 2hour cerebral artery occlusion was done followed by 22hour reperfusion. The rats were sacrificed immediately after reperfusion. ② Sham and middle cerebral artery occlusion group (SS+MCAO), sham operation replaced ischemic preconditioning, all the rest was the same as the first group. ③ Sham surgery group (SS+SS), two times of sham operation were performed on rats. The model was evaluated by neurological function scoring, cerebral infarction volume measurement, and pathological study.ResultsThe neurological function scores at day 4 and day 7 of IP+MCAO group were significantly lower compared with that of the SS+MCAO groups (t=4.025，2.683；P<0.05). The cerebral infarct volume at day 1, 3 and 7 of IP+MCAO group was significantly smaller compared with that of the SS+MCAO group (t=8.940-10.554,P<0.05). ConclusionSuturing occlusion method is a practicable technique for the establishment of ischemic tolerance model.

    ［KEY WORDS］brain ischemia; reperfusion; ischemic tolerance; ischemic preconditioning

    近年研究发现，短暂性脑缺血对神经细胞起保护作用，可抵御其后发生的严重脑缺血，减轻缺血组织的病变程度，即诱发了脑的缺血耐受（IT）。建立脑缺血耐受的模型对进一步研究预缺血对脑梗死神经保护作用的机制有重要意义。本文采用线栓法建立大脑中动脉阻塞再灌注动物模型，先后两次线栓堵塞制备脑缺血耐受模型，通过神经功能缺损评分、TTC染色测定梗死体积、苏木精伊红染色观察病理变化方法对模型进行评价，并探讨其应用价值。

    1  材料和方法

    1.1  线栓制备

    参照BELAYEV等[1]的方法处理线栓。线栓购自北京沙东生物技术有限公司，直径0.24 mm。选择一端加热成光滑球形，在距球形端18.5 mm处用记号笔作一标记，并用细砂纸在距球端5 mm处打磨，然后均匀涂布一层硅胶，使之直径达0.26～0.28 mm。置于37 ℃温箱中烘干备用。  

    1.2  动物及分组

    健康雄性Wistar大鼠84只，体质量为250～300 g。随机分成3组：预缺血+再缺血组（IP＋MCAO组，40只）、假手术＋再缺血组（SS+MCAO组，40只）、假手术对照组（SS+SS组，4只）。

    1.3  模型制备

    1.3.1  预缺血  参照LONGA线栓法[2]及文献[3,4]进行。

    1.3.2  再缺血  预缺血再灌注后，在再灌注1、3、7、14、21 d将线栓推进再次阻断大脑中动脉2 h，然后退出线栓再灌注22 h后处死动物。动物清醒后观察大鼠行为，进行神经症状评分，以动物清醒后出现对侧前肢不能伸展、爬行时向对侧转圈作为造模成功。舍弃标准如下：线栓插入深度不足,无明显神经功能缺损表现或症状很轻；手术时出血较多、症状严重；蛛网膜下隙出血、MCA起始部或其附近的WILLIS环动脉有凝血块；大鼠未能存活到规定时间点而死亡。死亡动物通过随机原则补齐数量并重新造模。

    1.4  神经功能缺损评分

    参照BEDERSON评分法[5]进行评分。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。分值越高，动物行为障碍越严重。评分1分以上者定为造模成功。

    1.5  脑梗死体积测定

    每组随机选取4只大鼠，快速断头取脑，于距额极2 mm处向后连续等距切取5个冠状脑片，间距为2 mm，37 ℃水浴，避光、体积分数0.01 TTC磷酸缓冲溶液中染色30 min，蒸馏水冲洗、40 g/L多聚甲醛固定后数码相机照相，测各层梗死面积，计算梗死体积。梗死体积=各层梗死面积之和×层间隔。

    1.6  脑组织病理观察

    每组随机选取4只大鼠，心脏灌注生理盐水、40 g/L 多聚甲醛各约200 mL，断头取脑，取前囟后3～6 mm部分，40 g/L 多聚甲醛后固定后脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5 μm。苏木精伊红染色后镜下观察组织病理变化。

    1.7  统计学处理

    采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，所有数据采用均值±标准差（±s）表示。数据间比较采用t检验及重复测量方差分析。

    2  结    果

    2.1  动物死亡原因

    实验中动物共死亡46只，死亡率为35.38％，对照组无动物死亡。动物死亡原因见表1。

    2.2  神经功能缺损评分

    SS+SS组神经功能评分为0。IP+MCAO组各时间点神经功能评分均低于SS+MCAO组，其中，3、7 d之间的差异具有统计学意义（t=4.025、2.683，P<0.05、0.01）。SS+MCAO组不同时间点之间比较差异无显著性（P>0.05)。IP+MCAO组再缺血3 d 与其他时间比较，差异具有显著意义（F=3.55，P<0.05）。见表2。

    2.3  梗死体积测定

    SS+SS组TTC染色脑组织呈均匀红色，无梗死灶。SS+MCAO组与IP+MCAO组脑组织染色均见白色缺血灶，主要位于额、顶、颞叶皮质，海马区亦可见缺血灶。IP+MCAO组再缺血1、3、7 d脑组织梗死体积较SS+MCAO组相应时间明显减小，差异具有极显著意义（t=8.940～10.554，P<0.01）。IP+MCAO组以3、7 d梗死体积减小最为明显，1、3、7 d比较差异具有显著性（F=33.18，P<0.05）。见表3。表1  各组动物死亡原因 表2  各组动物不同时间点神经功能缺损评分比较表3  各组动物脑组织梗死体积比较

    2.4  病理学变化

    大体改变：缺血侧大脑表面呈不同程度的饱满、苍白等脑水肿征象。光镜所见：SS+SS组的神经细胞的数量及形态分布正常。SS+MCAO组与IP+MCAO组海马区均表现不同程度的损伤改变，如细胞数减少、形态肿胀，细胞排列紊乱；梗死灶中心区组织明显稀疏，神经细胞出现脱失及变形，胞核固缩、溶解，失去完整结构；梗死灶周边区神经元、神经胶质细胞肿胀，甚至胞核固缩、浓染，并可见胶质细胞浸润。IP+MCAO组的脑梗死灶中心区较SS+MCAO组明显减小，周围区结构完整的神经细胞明显增多，组织水肿程度减轻；海马区细胞数量减少不明显，排列相对整齐。

    3  讨    论

    脑缺血耐受是近年提出的新概念，是指给予短暂的亚致死性缺血后诱导的脑的内源性保护机制，从而对后续长时间缺血损伤产生耐受及自身保护作用。亚致死性预缺血能诱导脑缺血耐受[6]，已被许多学者所证实。建立脑缺血耐受的模型对探讨其分子机制及内源性脑保护作用有重要意义。

    实验动物的选择上，由于大鼠具有成本低、脑血管解剖特性与人类相似等特点，目前仍是脑缺血研究最常用的动物。国内外对大鼠局灶性脑缺血动物模型进行了大量研究。20世纪80年代KOIZUMI等[7]和LONGA等[2]创建了不开颅的大鼠MCA可逆性脑梗死模型，该模型勿需开颅，对缺血及再灌注时间易于控制，因此逐渐成为局灶性脑缺血实验研究最流行的方法。

    我们采用该方法建立大脑中动脉阻塞再灌注模型，先后两次线栓堵塞大脑中动脉，通过观察模型大鼠神经功能评分、测定脑梗死体积来确定脑缺血耐受的产生。结果显示，预缺血10 min后3～7 d的时间内，能产生较明显的缺血耐受，预缺血组梗死体积较假手术组明显减小，神经功能缺损评分也明显低于假手术组。同时，苏木精伊红染色结果显示，预缺血组的缺血程度、范围及脑水肿程度均较假手术组轻。因此我们认为，10 min的预缺血可以诱导脑缺血耐受，具有神经保护作用。这与文献[8]报道的结果一致。

    线栓处理是模型制备的关键步骤之一，线栓制备方法直接关系到模型成功与否及蛛网膜下隙出血的发生率。LONGA等[2]的方法是将线栓头端烧成球形，KOIZUMI等[7]是在线栓头端涂以硅树脂，而BELAYEV等[1]则是先加热使线栓头端变钝，然后涂以多聚赖氨酸溶液。国内研究的处理方法也都不尽相同[9,10]。我们的预实验显示，单纯加热线栓头端使之成球形的方法并不能造成明显的梗死灶。参考文献并结合预实验结果，我们采用线栓头端加热成球形、然后涂布硅胶的方法。从本实验结果看，制备的模型出现明显梗死灶，且蛛网膜下隙出血的发生率较低。

    本文实验中动物的死亡率是35.38％。死亡原因主要有：出血，包括游离血管时破裂出血、血管夹闭不全出血、ECA线头脱落出血、线栓被拔出出血等；呼吸停止死亡， 可能与术中对迷走神经刺激过多、过重，导致呼吸道分泌物过多、呼吸困难死亡；再缺血死亡，包括因感染、粘连、肉芽组织过度生长、ICA内膜增生等引起线栓入颅困难，插线失败，或因严重的缺血损伤和脑水肿而造成死亡；蛛网膜下隙出血，多由于插线过深，将WILLIS环的血管刺破而造成。对于插线深度文献有不同研究，CARCIA[11]研究体质量为(270±15) g的大鼠，认为插入深度为(18.2±0.5)mm较为合适。而ZAROW等[12]研究280～320 g 的SD大鼠，认为插入22 mm的深度比18 mm更容易造模成功。我们的实验结果也显示，（18.0±0.5）mm的深度足以产生较恒定的梗死灶，过深会使SAH的发生率升高。总之，本实验的模型制备需要先后两次线栓阻塞大脑中动脉，致动物的死亡率偏高，对操作者的技术要求也相对较高，需要进一步的实验研究，提高造模成功率。

【参考文献】
  [1]BELAYEV L, ALONSO O F, ZHAO W, et al. Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture. Neurological and pathological evalution of an improved model[J]. Stroke, 1996,27(9):16161622.

[2]LONGA E Z, WEINSTEIN P R, CARLSON S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):8991.

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[6]KITAGAWA K, MATSUMOTO M, TAGAYA M, et al. “Ischemic tolerance” phenomenon found in the brain[J]. Brain Res, 1990,528(1):2126.

[7]KOIZUMI J, YOSHID Y, NAKAZAWA T, et al. Experimental studies of ischemia brain edema, a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirulation can be introduced in the ischemia area[J]. Stroke, 1986,8:1.

[8]CHEN J, GRAHAM S H, ZHU R L, et al. Stress proteins and tolerance to focal cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1996,16(3):566577.

[9]叶建锋，李涛平，舒斯云，等. 大鼠脑缺血模型的改进和脑缺血再灌注损伤诱发细胞凋亡的研究[J]. 中国急症医学， 1999，19(4):197199.

[10]马常升，马文领，戴维国，等. 插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究[J]. 解剖学杂志, 1999,22(3):209211.

[11]CARCIA T H. A reliable method to occlude a middle cerebral artery in wistar rats[J]. Stroke, 1993,24(9):1423.

[12]ZAROW G J, KARIBE H, STATES B A, et al. Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats:effect of suture insertion distance on cerebral blood flow infarct distribution and infart volume[J]. Neurol Res, 1997,19(3):409416.

作者单位：淄博市中心医院神经内科，山东 淄博 25503