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【摘要】 目的 探讨大鼠蛛网膜下隙出血(SAH)后骨髓源性神经干细胞(BMSCsDNSCs)移植对脑组织的修复作用。方法 成功建立Wistar大鼠SAH模型后,随机分为对照组、DMEM组和BMSCsDNSCs组,SAH模型两次采用枕大池注入0.3 mL自体血的方法建立,后两组在模型制作后24 h于枕大池分别注入30 μL的DMEM和BMSCsDNSCs。BMSCsDNSCs用5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记。 用神经功能等级评分对移植后大鼠的神经功能进行评估;用免疫组化染色观察BrdU阳性细胞。结果 BMSCsDNSCs组10~40 d神经功能等级评分与其他两组相比,差异有显著统计学意义(F=3.508~4.444,q=3.01~3.67,P<0.05)。在BMSCsDNSCs移植后约40 d,取脑组织行免疫组织化学染色检查,大脑皮质内可见BrdU阳性细胞存在。结论 SAH后移植BMSCsDNSCs可以有效地促进大鼠神经功能的恢复;BMSCsDNSCs能够分化为神经元从而发挥对SAH后的大脑的修复作用。
【关键词】 蛛网膜下隙出血 骨髓祖代细胞 移植
THE REPAIRING EFFECT OF TRANSPLANTATION OF BONE MARROWDERIVED NEURAL STEM CELLS ON BRAIN TISSUE OF ADULT RATS AFTER SUBARACHNOID HEMORRHAGEWANG JINWEI, YAO WEICHENG, WANG JINGFENG, et al(Department of Neurosurgery, The Affliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo study the repairing effect of transplantation of bone marrowderived neural stem cells (BMSCsDNSCs) on the brain tissue of rats with subarachnoid hemorrhage (SAH).MethodsFortyfive adult Wistar rats were randomly divided into three groups, i.e.control,DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) and BMSCsDNSCs. After the models had been made, 30 μL of DMEM or BMSCsDNSCs was injected into the cisterna magna of the models of the latter two groups, respectively.The SAH models were induced by injection twice of 0.3 mL autologous blood into the cisterna magna. BMSCsDNSCs were labeled with 5Bromo2’deoxyuridine (BrdU).The neurological functional grade score was used to evaluate the nerve function of rats at different intervals following the transplantation.The BrdU positive cells were searched with immunohistochemical staining method.ResultsDistinguished amelioration in the nerve function was observed in BMSCsDNSCs group (F=3.508-4.444,q=3.01-3.67,P<0.05); The BrdU positive cells were detected in the brains of the rats.ConclusionTransplantation of BMSCsDNSCs can effectively improve the nerve function of rats with SAH. The new generated neurons differentiated from BMSCsDNSCs may exert a repairing influence on the brain after SAH.
[KEY WORDS]subarachnoid hemorrhage; bone marrow stromal cells; transplantation
近来研究结果表明,胚胎神经干细胞(NSCs)移植能促进损伤脑区的修复,改善病人的神经功能[1]。本实验将大鼠骨髓源性神经干细胞(BMSCsDNSCs)移植入蛛网膜下隙出血(SAH)大鼠枕大池,并观察BMSCsDNSCs对SAH大鼠脑组织的修复作用。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
成年Wistar大鼠45只,体质量为200~250 g,由青岛市实验动物中心提供,将动物随机分为对照组(A组)、DMEM组(B组)和BMSCsDNSCs组(C组)。
1.2 仪器与试剂
OLYMPUSCH显微镜由日本奥林巴斯公司生产。DMEM/F12培养液由GIBCO公司提供, 5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.3 大鼠BMSCsDNSCs分离培养与鉴定以及BrdU的标记
用免疫组化技术对细胞进行兔抗NSE单抗鉴定,发现了具备神经元样细胞。培养细胞至移植前48 h,加入50 mg/L的BrdU标记[2]。
1.4 SAH大鼠模型的制备
枕大池两次注血法制作SAH模型[3]。
1.5 DMEM组、BMSCsDNSCs组的处理
大鼠SAH模型制作成功后24 h再次麻醉、固定,BMSCsDNSCs组大鼠于枕大池穿刺平缓注入30 μL的BMSCsDNSCs细胞悬液,DMEM组于枕大池平缓注入30 μL DMEM,注入时间5 min。术毕缝合头皮,腹腔注射庆大霉素10 000 U抗菌治疗,回笼饲养。BMSCsDNSCs组在移植后40 d处死,取大脑组织石蜡切片,进行BrdU免疫组织化学检查。
1.6 评估标准
采用神经功能等级评分对各组大鼠神经功能进行评估[4]。DMEM组和BMSCsDNSCs组在治疗后5、10、20、30、40 d进行检测评分,同时记录对照组相应时间的评分。
2 结 果
BMSCsDNSCs组10~40 d神经功能等级评分与其他两组相比较,差异有显著性(F=3.508~4.444,q=3.01~3.67,P<0.05)。在BMSCsDNSCs移植后约40 d,取脑组织行免疫组织化学染色检查,大脑皮质可见BrdU阳性细胞存在。
表1 各组大鼠不同时点神经功能评分比较(±s)组别n第5天第10天第20天第30天第40天A组1510.00±1.659.13±1.367.13±1.255.40±0.994.27±0.96B组1510.07±1.498.93±0.967.00±1.415.27±0.884.13±1.06C组1510.20±1.158.00±1.076.07±0.884.47±1.063.13±1.36
3 讨 论
SAH后由于脑血管痉挛的发生,加重脑组织的缺血低氧,造成神经元的不可逆损害[5]。本实验采用枕大池两次注血法制作了大鼠SAH模型,并在24 h后进行BMSCsDNSCs移植治疗。移植后于不同时点对实验大鼠进行了神经功能等级评分,统计学分析表明移植治疗的大鼠神经功能较对照组明显改善,这与胚胎脑来源的NSCs改善神经功能结果一致[1],为BMSCsDNSCs移植治疗中枢神经系统疾病提供了理论基础。用免疫组化技术可观察到BMSCsDNSCs组大脑皮质有BrdU阳性细胞,沿皮质排列,并向内迁徙,提示BrdU标记的BMSCsDNSCs可能修复了损伤的大脑组织,从而改善了神经功能。
NSCs培养并移植可治疗多种中枢神经系统疾病,但由于移植组织来源、免疫排斥及伦理学等方面的限制,很难广泛用于临床。本实验的结果表明,以BMSCsDNSCs进行移植治疗神经功能缺陷是可行而有效的,而且克服了上述限制带来的一系列问题,尤其是自体BMSCsDNSCs无免疫排斥,为将来以人BMSCsDNSCs作为种子细胞进行自体移植提供了实验依据。
总之,随着研究的深入, BMSCsDNSCs将会有广阔的应用前景。
【参考文献】
[1]RIESS P, ZHANG C, SAATRNAN K E. Transplanted neural stem cells survive,differentiate,and improve neurological motor function after experimental traumatic brain injury[J]. Neurosurg, 2002,51(4):10431052.
[2]伦鹏,孟庆海,刘广义. BFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察[J]. 青岛大学医学院学报, 2006,42(1):4446.
[3]杜固宏,周良辅. 实验性蛛网膜下隙出血动物模型的建立[J]. 中国临床神经科学, 2000,8(1):70.
[4]郭云良,姚维成,高焕民,等. 神经生物学技术[M]. 青岛:中国海洋大学出版社, 2004:811.
[5]VOILATH B A, WEIR B K. Intracellular mechanism involved in the response of cerebravascular smoothmuscle cells to hemoglobin[J]. J Neurosurg, 1994,80(2):261268.
作者单位:青岛大学医学院附属医院神经外科,山东 青岛 266003