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【摘要】 目的 探讨利用肺癌组织、癌旁组织p16基因甲基化的差异来指导精确放疗的临床价值。方法 选取33例肺部疾病住院病人手术切除的肺组织标本，其中29例为肺癌，4例为良性肺部疾病。采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)法检测其p16基因甲基化状态。 结果 29例肺癌组织标本中12 例（41.4%）在p16基因启动子区域呈现异常甲基化，近癌旁组织、远癌旁组织标本中均未检测出甲基化存在。4例良性肺部疾病中肺脓肿1例，肺炎性假瘤3例，手术切除标本中均未检测出甲基化存在。结论 MSPCR 技术对肺癌病人标本中的异常甲基化检测具有特异性，可进一步应用于肺癌生物靶区设计的探讨。
【关键词】 癌 非小细胞肺 p16基因 放射疗法 聚合酶链反应
A PRELIMINARY STUDY OF RADIOTHERAPEUTIC TARGET REGION DESIGN FOR NSCLC BY DETECTION OF p16 GENE METHYLATIONZHANG LIJIAN (Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo assess the value of designing the target region by using the difference of p16 gene methylation between the tissues of lung cancer and its surrounding tissues.MethodsThe lung tissue of 33 hospitalized patients were collected, of which, 29 cases were lung cancer, four were benign diseases. MSPCR was used to detect. The status of p16 gene methylation.ResultsIn lung cancer, 12 cases (41.4%) were found to have abnormal methylation in promoter area of p16 gene. No abnormal methylation was observed in both the benign lung diseases and the tissues that adjacent to the cancer.ConclusionThe MSPCR is of specificity in detection of abnormal methylation of lung cancer specimen, which can be used in designing biological target region for lung cancer.
［KEY WORDS］carcinoma, nonsmall cell lung; p16 gene; radiotherapy; polymerase chain reaction
近年来,有关抑癌基因p16启动子区域的CpG岛甲基化与肺癌发生发展的关系日益受到人们的重视。另外，随着放射物理技术的不断提高，对肺癌放疗靶区的要求也日趋精细化。本研究运用较为成熟的甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)方法，检测肺癌和肺部良性疾病病人组织标本中p16基因的甲基化状态,并初步探讨了如何利用其差异来指导精确放疗靶区的设计，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本收集
选取2006年4～8月本院住院病人手术切除的肺脏病变组织标本33例。病理组织学诊断为肺癌29例, 其中腺癌16例, 鳞癌7例, 腺鳞癌2例，细支气管肺泡癌2例，大细胞肺癌1例，类癌1例；肺部良性疾病4例,其中肺炎性假瘤3例，肺脓肿1例。新鲜手术标本先切取病变及其周围组织，经冷冻切片机迅速冷冻后，取距肿瘤3～6 mm的组织为近癌旁组织，7～9 mm的组织为远癌旁组织。切取标本于-70 ℃下保存。
1.2 DNA制备
采用BioDev动物基因组DNA小量快速提取试剂盒（北京博大泰克生物基因有限公司）提取组织DNA。取1 μg左右DNA置于50 μL缓冲液中，加2 mol/L NaOH 5.5 μL,37 ℃水浴10 min后，加入新鲜配制的10 mmol/L氢醌30 μL及3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL，样品混匀后于50 ℃孵育16 h。应用Wizard DNA Purification kit (Promega) 对处理后的DNA进行纯化。向已纯化的DNA加入NaOH至终浓度0.3 mol/L，室温放置5 min,最后用无水乙醇沉淀DNA,以适量双蒸水溶解修饰处理的DNA, 立即扩增或-70 ℃冻存备用。
1.3 PCR扩增
参照文献[1]设计针对p16 基因甲基化的特异性引物。有义链5′TTATTAGAGGGTGGGGCG GATCGC，反义链5′GACCCCGAACCGCGACCGTAA,扩增片段长度为150 bp。 针对p16 基因非甲基化的特异引物为：有义链5′TATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT,反义链5′CAACCCCAAACCACAACCATAA，扩增片段长度为151 bp。 PCR反应在Mastercycler ep384 PCR仪(德国EPPENDORF)上进行。总反应体积为50 μL，反应体系如下：1.5 mmol/L的MgCl2,0.1 mmol/L的dNTP,0.4 μmol/L 的上下游引物，TaqDNA聚合酶5 μL, DNA模板5 μL。循环参数：95 ℃变性5 min;然后95 ℃ 30 s，58 ℃（非甲基化）或62 ℃（甲基化）30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环;最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经3 g/L琼脂糖凝胶电泳,EB染色, 凝胶成像分析仪（美国VILBER LOURMAT）下观察结果并照相。
2 结 果
29例肺癌组织标本中,12例（41.4%）在p16基因启动子区域呈现异常甲基化。在肺癌相应的近癌旁和远癌旁组织标本及良性肺组织标本中未检测出甲基化存在。肿瘤组织与癌旁组织及良性肺组织的甲基化差异有显著性（χ2=11.53,P<0.05）。肺癌非甲基化的标本为中分化12例，低分化3例，分化不明者2例；肺癌甲基化的标本为中分化4例，低分化6例，分化不明者2例。肺癌非甲基化的标本大体类型为中央型7例，周围型10例；肺癌甲基化的标本大体类型为中央型3例，周围型9例。肺癌非甲基化的标本组织类型为鳞癌4例，腺癌10例，类癌1例，大细胞癌1例，腺鳞癌1例；肺癌甲基化的标本组织类型为鳞癌3例，腺癌8例，腺鳞癌1例。肺癌非甲基化的标本中Ⅰ期9例，Ⅱ期2例，Ⅲ期6例；肺癌甲基化的标本中Ⅰ期8例，Ⅱ期1例，Ⅲ期3例。甲基化状态与肿瘤的分化、大体类型、组织类型、分期无关(P>0.05)。
3 讨 论
DNA甲基化是一种重要的基因调控方式, 是脊椎动物DNA惟一的自然化学修饰方式[2]。DNA高甲基化水平的改变在非小细胞肺癌的发生、发展中起重要的作用,特别是抑癌基因的高甲基化诱导染色体不稳定，从而导致非小细胞肺癌的发生。MSPCR是近年来新兴的一种检测DNA甲基化的方法，具有快速、经济、灵敏度高、相对简单的特点，其可靠性已得到了广泛验证。DNA 甲基化的不平衡为肿瘤的一大特点,可作为恶性肿瘤恶性克隆增殖的分子基因标志,为临床提供一种新的检测恶性肿瘤细胞的分子基因标志,也为肿瘤的诊断、鉴别诊断开辟新途径,同时对预测某些良性肿瘤的恶性变具有重要的参考价值[4]。
在肺癌组织中，p16基因的失活主要以一条等位基因的丢失,另一条等位基因的甲基化为主[3]。BEARZATTO 等[5]研究显示,p16基因甲基化在肺癌组织中发生率为63%,在相应血清中为34%,与K2ras 突变、微卫星改变相比较,是一个独立因素。而NG等[6]研究结果显示，p16基因甲基化在非小细胞肺癌组织中的发生率为42%,血清中为14%,它们均与肿瘤分期( Ⅲ、Ⅳ期) 和低生存率相关(P<0.05)。本研究结果显示，甲基化在肺癌组织中发生率与相关文献近似。可能本研究病例数偏少，未能得出与肿瘤分化、分期的相关性。p16基因甲基化与生存率的关系，有待于进一步随访。
放射治疗的目的在于通过提高肿瘤靶区剂量和减少靶区周围正常组织放射损伤从而不断提高治疗的局部控制率，进一步提高生存率和改善生存质量。3DCRT 能明显提高非小细胞肺癌病人近期疗效及局部控制率,不同程度地延长生存期,改善生活质量[7]。 临床靶区(CTV)是为了包括亚临床病灶而在肿瘤区（GTV）外加的一定范围，要求包括肉眼肿瘤区旁边的亚临床病灶，即可能的显微镜下侵袭范围。这个范围在临床上是看不到的，并且受检查方法、肿瘤的生物特性、解剖关系影响。在非小细胞肺癌病人常规放疗中，一般在肉眼肿瘤或影像学肿瘤外放10～20 mm作为CTV，目前，由于现有的影像学手段尚无法显示肿瘤的亚临床病灶，所以如何能够恰当地确定CTV是肿瘤科医师最大的挑战之一。GIRAUD等[8]对70例非小细胞肺癌手术切除标本的354张切片进行研究，其中腺癌176张,鳞癌178张。光镜下测量发现，最远的微观病灶与肿瘤边缘的距离腺癌平均为2.69 mm,鳞癌为1.48 mm,提出对腺癌和鳞癌分别使用8 mm和6 mm的外放就能包括95%病人的微观浸润病变。
利用非小细胞肺癌发生中DNA甲基化特征可对其进行早期的诊断，并指导精确放疗靶区的勾画。本研究从分子生物学角度确定了肺癌的CTV，本实验结果表明，肉眼肿瘤或影像学肿瘤外放10 mm作为CTV是安全的。
总之，MSPCR技术检测肺癌p16基因甲基化具有特异性，可进一步应用于肺癌放疗靶区设计的分子生物学研究。
【参考文献】
[1]HERMAN J G, GRAFF J R, MYOHANEN S, et al. Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sic USA, 1996,93(18):98219826.
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[5]BEARZATTO A, CONTE D, FRATTINI M, et al. p16IN K4A hypermethylation detected by fluorescent met hylation 2 specific PCR in plasmas from nonsmall cell lung cancer[J]. Clinical Cancer Res, 2002,8(12):37823787.
[6]NG C S H, ZHANG J, WAN S, et al. Tumor p16M is a possible marker of advanced stage in nonsmall cell lung cance[J]. J Surg Oncol, 2002,79 (2):101106.
[7]王旬果,孙福銮,王建军，等. 三维适形放射疗法治疗非小细胞肺癌的效果[J]. 齐鲁医学杂志， 2005，20(2):112114.
[8]GIRAUD P, ANTOINE M, LARROUY A, et al. Evaluation of microscopic tumor extension in nonsmallcell lung cancer for threedimensional conformal radiotherapy planning［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2000，46（4）：10151024.
作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东 青岛 266003