冠心病病人纤维蛋白原β148C/T基因多态性的检测

【摘要】  目的 探讨冠心病病人纤维蛋白原(Fg)β基因启动区多态性位点β148C/T基因多态性频率分布及其与血浆Fg水平的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析方法，测定128例冠心病病人（冠心病组）和110例健康体检者（对照组）Fg β148C/T基因多态性频率分布，凝血酶原时间法测定血浆Fg水平。结果 冠心病组Fg β148C/T基因多态性与对照组比较差异有显著性（χ2=12.95，P<0.01）；冠心病组T等位基因的频率为0.309, 明显高于对照组（0.209）(χ2=6.04，P<0.05)。冠心病组血浆Fg水平高于对照组(t=2.98，P<0.01)；冠心病病人148CC和148CT基因型组Fg水平高于对照组(t=2.231、2.886，P<0.05)，148TT基因型组Fg水平与对照组比较差异无显著性（t=0.559，P>0.05）。结论 Fg β148C/T基因多态性与冠心病的发生有关，可能是通过等位基因T影响血浆Fg水平在冠心病的发生机制中起作用。

【关键词】  纤维蛋白原 基因多态性 冠状动脉硬化

    A DETECTION POLYMORPHISM OF FIBRINOGEN GENE 148 C/T AND PLASMA FIBRINOGEN LEVELS IN PATIENTS WITH CORONARY HEART DISEASEZOU HONGLI, SONG YUQIANG, YANG FENG (Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266042, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the frequency of betafibrinogen (betaFg) gene148 C/T  polymorphisms and their association with plasma fibrinogen levels in patients with coronary heart disease (CHD).MethodsThe B beta gene Fg148 C/T polymorphism was identified by polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) in 128 patients with CHD and 110 healthy controls.  Prothrombin time assays were performed to measure the plasma fibrinogen levels.ResultsThe distribution of Fg148 C/T gene polymorphism was inaccordance with the HardyWeinberge quilibrium (P>0.05). The genotype frenquencies of 148 C/T, the  frenquencies of  T allele, the plasma fibrinogen level, and the plasma fibrinogen levels with T148 alleles (148CT,148TT) in CHD patients were all higher than the controls.ConclusionThe incresesed plasma Fg level is a risk factor of CHD.The betafibrinogen gene Fg148 C/T polymorphism may play an important role in the pathogenesis of CHD.

    ［KEY WORDS］fibrinogen; polymorphism; coronary  arteriosclerosis

    血浆纤维蛋白原(Fg)水平升高是引起缺血性心脏病发病的独立危险因素之一[1]。Fg受许多因素影响，如年龄、性别、感染、吸烟、高血压、糠尿病及遗传因素。有关Fg基因多态性及其与血浆Fg浓度、动脉粥样硬化血栓性疾病的相关性研究结果不一致[2]。本研究采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析方法, 对冠心病病人Fg基因启动子区β148C/T基因多态性进行分析,并检测血浆Fg浓度，探讨中国汉族人群Fg β148C/T基因多态性与血Fg水平和冠心病的关系。

    1  对象和方法

    1.1  检测对象

    冠心病组：128例，为青岛大学医学院附属医院门诊和住院病人，男72例，女56例；年龄42～78岁,平均（61.5±9.7）岁,诊断符合世界卫生组织(WHO)确定的冠心病诊断标准。正常对照组：110例，为同期至我院进行体检的健康人，男58例，女52例；年龄45～77岁，平均（59.1±11.3）岁。两组人群均检查血压、血脂、血糖、ECG，了解病史，排除糖尿病、肝肾功能异常、出凝血异常等疾病。两组年龄、性别构成、空腹血糖、血压、血脂水平比较无显著性差异（P>0.05）。

    1.2  检测方法

    1.2.1  血标本采集及DNA制备  抽取空腹静脉血1 mL,加20 mL的EDTA抗凝，4 ℃冰箱保存。应用北京赛百盛公司提供的DNA提取试剂盒提取DNA。

    1.2.1  聚合酶链反应  根据文献[3]设计引物序列：上游引物5′GTGCCCTAACTTCCCATCA 3′，下游引物5′AAGCTCCAAGAAACCATCCT 3′。PCR反应体系：共30 μL。PCR循环参数：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃ 10 min。将反应产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，每孔上样10 μL PCR产物+2 μL溴酚蓝，100 V电泳30 min，在紫外线成像系统下观察电泳结果。

    1.2.3  酶切  采用20 μL酶切反应体系:双蒸水13 μL,10×Buffer 2 μL,HindⅢ1 μL,PCR产物4 μL。反应条件：在37 ℃温箱放置1.5 h。将反应产物经25 g/L琼脂糖凝胶电泳，每孔上样10 μL酶切产物+2 μL溴酚蓝，90 V电泳40 min，在紫外线成像系统下观察电泳结果。

    1.2.4  血浆Fg测定  晨起抽取受检者空腹静脉血，应用凝血酶原时间法在自动凝血仪上检测血纤维蛋白原水平。

    1.3   统计学方法

    计数资料比较采用卡方检验，计量资料比较采用ｔ检验和F检验（不符合正态分布者，先取对数），用SPSS 11.5统计软件包处理数据。

    2  结    果

    2.1  两组Fg水平比较

    冠心病组血浆Fg水平为（3.57±1.02）g/L，对照组为（3.06±0.85）g/L，两组比较差异有极显著性(t=2.98，P<0.01)。

    2.2  Fg β148C/T基因多态性

    PCR产物的长度为286 bp，限制性内切酶Hind Ⅲ可特异性识别并切割AGCT序列。CC基因型两条等位基因均被切开，电泳呈现5、281 bp两条带；TT基因型有两个切割位点，电泳呈现5、102、179 bp共3条带，CT基因型电泳则出现5、102、179、286 bp共4条带（5 bp片段由于过小，在琼脂糖凝胶电泳中速度较快，均未能显示）（图1）。

    图1  Fg β148C/T 基因位点PCR产物酶切电泳结果

    M：Marker；①PCR产物；②TT基因型；③CC基因型；④CT基因型

    2.3  Fg β148C/T基因多态性及等位基因频率分布

    冠心病组Fg β148C/T基因型分布频率与对照组比较有显著性差异(χ2=12.95，P<0.01)，冠心病组148CC基因型分布频率降低，杂合子148CT的分布频率升高；对等位基因频率分析的结果表明，冠心病组少见型等位基因T的分布频率与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=6.04，P<0.05）。 冠心病组T等位基因的携带者占54.7%，对照组只占36.4%。见表1。表1  两组Fg β148C/T基因多态性及等位基因频率分布组  别n基因型的分布频率

    2.4  两组不同基因型血浆Fg水平

    冠心病组148CC和148CT病人的血浆Fg水平均高于健康对照组(t=2.231、2.886，P<0.05)，148TT病人的血浆Fg水平与对照组比较无显著性差异（t=0.559，P>0.05），将148CT和148TT合为一组后，冠心病组血浆Fg水平仍高于对照组(t=2.852，P<0.01)。见表2。表2  两组Fg β148C/T基因多态性与血浆Fg水平的关系

    3  讨    论

    Fg是肝脏合成的一种凝血因子，在凝血酶作用下，纤维蛋白原转变为纤维蛋白,后者可沉积在动脉内膜,与血小板膜上受体结合，导致血小板聚集引起内皮损伤；长期高浓度Fg可刺激内皮细胞合成分泌增加,Fg及其降解产物也可直接损害血管壁,刺激平滑肌细胞增生和迁移,引起血管内皮功能异常，并促进动脉粥样斑块的进展[1,4]。本研究结果显示，冠心病组的总Fg水平要高于对照组，与以前的的研究结果一致[5]。血浆Fg浓度超过5 g/L，发生血栓的危险性相应增加4倍，表明血浆中高纤维蛋白原水平可导致高凝状态,并且促进动脉硬化的形成和缺血性心脏病的发生。有研究认为，遗传对血浆纤维蛋白原浓度的影响约占51%[6],Fg的基因多态性被认为是导致个体间血浆Fg水平差异的遗传决定性因素,可能直接或间接作用于冠心病的发生和发展。

    本文研究结果显示，冠心病组等位基因148T和Fg β148C/T基因型频率高于正常对照组，冠心病组中148T等位基因携带者占54.7%，对照组只占36.4%，差异有显著意义。Fg β148C/T基因多态性与血浆Fg水平增高有关，但该多态性位点影响血浆Fg水平的机制尚未清楚。有人认为可能是Fg β148C/T基因多态性变化影响了Fg β基因的转录[7]。Fg是一种急性相蛋白，当机体处于损伤、炎症等应激状态时其合成会反应性增高。Fg的合成主要受肝细胞刺激因子和糖皮质激素的调控，其中白细胞介素6(IL6)是主要影响Fg合成速度的肝细胞刺激因子之一。研究已证实，在Fg β链基因5′端上游存在3个与IL6调控有关的位点，IL6与肝细胞膜IL6受体结合，可使酪氨酸蛋白激酶活性增加，进而启动细胞内一系列放大效应，使核转录因子经快速化学修饰作用后与IL6受体作用元件结合增强，提高Fg β基因转录效率。Fg β148C/T位点靠近IL6调控Fg β基因表达的受体作用元件，推测Fg β148C/T位点有可能是影响Fg水平的重要位点，β148C→T的多态性改变可能进一步提高了IL6与IL6受体的亲和力，从而更加增强了Fg β基因的转录[1]。

    本文研究结果显示，冠心病组的总Fg水平、148CC和148CT基因型病人Fg水平高于对照组，而两组148TT基因型没有差别，可能与样本例数太少有关，但将148CT和148TT合为一组后，148T等位基因携带者的Fg水平高于对照组，表明两组人群的Fg水平受Fg β148C/T多态性这一遗传因素影响。提示Fg β148C/T基因多态性与Fg水平及冠心病的发生均存在相关关系，148T等位基因在冠心病病人血浆Fg水平增高的过程中起重要的作用，148T等位基因可能是冠心病的易患因素。

    综上所述，Fg基因多态性是导致个体间血浆Fg浓度差异的重要遗传决定因素。Fg β148C/T多态性通过影响血浆Fg浓度而在冠心病发病中起着重要作用。148T等位基因可能是冠心病的易患因素，其具体作用机制尚需进一步的研究。

【参考文献】
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[2]马会利,葛均波,王颖,等. 纤维蛋白原及其相关基因β148和β854多态性与冠心病发病的相关性[J]. 中国动脉硬化杂志, 2005(3):107110.

[3]TYBJAERG H A, AGERHOLM L B, HUMPHRIES S E, et al. A common mutation (G445→A) in the beta fibrinogen promote rises an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of ischemic heart disease. A study of 9 127 in dividuals based on the Copenhagen City Heart Study[J]. J Clin Invest, 1997,99:30343039.

[4]FULLER G M, ZHANG Z. Transcriptional control nechanism of fibrinogen gene ezprission[J]. Ann NYAcad Sci, 2001,936:469470.

[5]陈淑芳,陈作元. 不稳定型心绞痛病人血清载脂蛋白A、B与冠状动脉造影血管病变的关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(1):3536.

[6]邢宏运,蔡望伟,李晓明,等. 纤维蛋白原B. β链基因1420G/A993C/T854G/A多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关联研究[J]. 中华医学遗传学杂志, 2006(6):2832.

[7]LAM K S, MA O C, WAT N M, et al. Beta fibrinogen gene G/A455 poly morphism in relation to brinogen concentrations and ischaemic heart disease in Chinese patients with typeⅡdiabetes[J]. Diatetologia, 1999,42:12501253.

作者单位：青岛市中心医院心内科，山东 青岛 266042