顺铂低剂量节律化疗抑制小鼠H22肝癌血管生成观察

【摘要】  目的 探讨顺铂低剂量节律(LDM)化疗对小鼠H22肝癌血管生成的影响，观察其抑瘤效果和毒副作用。方法 昆明小鼠皮下接种H22细胞，随机分为4组(每组12只)，节律组A：顺铂0.6 mg/(kg·d)每日腹腔注入，每周5次；节律组B：顺铂1 mg/(kg·d)隔日腹腔注入，每周3次；对照组：生理盐水0.2 mL每日腹腔注入，每周5次，持续2周；最大耐受剂量(MTD)组：顺铂9 mg/(kg·d)一次腹腔注入。每隔2 d测量小鼠体质量及肿瘤直径。接种后第15天处死小鼠称瘤质量，行组织学观察，免疫组化法检测肿瘤内微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果 与MTD组相比较，节律组A、节律组B肿瘤生长缓慢，无明显的体质量减小。节律组A、节律组B、MTD组的抑瘤率分别为66.78%、55.56%、39.44%。节律组A、节律组B肿瘤MVD、VEGF、MMP2表达较对照组、MTD组显著减少(F=9.56、9.38、10.17,q=3.56～6.18,P<0.05)；PCNA指数与对照组比较差异无显著性 (F=11.95,q=0.87,P>0.05)；MTD组PCNA指数较节律组、对照组明显降低，差异有显著性（q=6.18、6.10,P<0.01)。节律组A、节律组B瘤组织可见大量的细胞变性坏死，对照组和MTD组少见。结论 顺铂LDM化疗可显著抑制小鼠H22肿瘤的生长及血管生成，化疗效果好且毒性低；其抗血管生成作用可能与肿瘤内VEGF、MMP2表达下调有关。

【关键词】  顺铂;肝肿瘤;药物疗法;新生血管化，病理性;小鼠

　　OBSERVATION OF ANTIANGIOGENIC EFFECT OF LOWDOSE METRONOMIC CISPLATIN ON LIVER H22 CELL CARCINOMA GROWTH IN MICE

　　HOU JIYUAN, SHEN FANGZHEN, WANG YANTAO, et al

　　(Department of Oncology, The Affiliated Hospital Of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;
　　［ABSTRACT］ Objective To observe the antiangiogenic effect of lowdose metronomic (LDM) cisplatin chemotherapy on growth of liver cell carcinoma H22 in mice. Methods Fortyeight Kunming mice were subcutaneously implanted with cells of liver carcinoma H22, which were evenly divided into four groups: LDM group A, cisplatin (0.6 mg·kg-1·d-1), once a day, five times a week; LDM group B, cisplatin (1 mg·kg-1·d-1), once every other day; maximum tolerated dose (MTD): cisplatin (9 mg·kg-1·d-1) single dose; control group: normal saline (0.2 mL),once a day, five times per week for two weeks, the drug was administered intraperitoneally. The weight of the mice and tumor diameter were measured every three days. The tumors were then weighed on day 15 when the mice were killed. Tumor microvessel density (MVD), the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase2 (MMP2) and the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were detected by immunohistochemical staining. Results Delay of tumor growth without apparent body weight loss was noticed in the mice of LDM groups A and B, compared with those of MTD group. The cancer suppressive rate of LDM groups A and B, and MTD group were 66.78%, 55.56%, 39.44%, respectively. Expression of VEGF and MMP2 and MVD were significantly lower in the mice in LDM groups A and B than those of MTD group and control group (F=9.56,9.38,10.17;q=3.56-6.18;P<0.05), while the differences of PCNA between LDM groups and control group were not significant (F=11.95,q=0.87，P>0.05), the PCNA index in MTD group was lower than that in control group and LDM groups (q=6.18,6.10;P<0.01). Conclusion Tumor growth and angiogenesis are significantly inhibited in mice received LDM treatment. The effect of antiangiogenesis may be correlated with the low expression of VEGF and MMP2 in the tumors.
   
　　［KEY WORDS］ Cisplatin; Liver neoplasms; Drug  therapy; Neovascularization, pathologic; Mice
   
　　肝细胞癌(HCC)恶性程度高，进展迅速，术后易复发和转移，目前尚缺乏有效的治疗药物。肝细胞癌为典型的多血管肿瘤，抗血管生成在其治疗中有着诱人的前景。近几年研究显示，一些化疗药物在采用小剂量(通常是最大耐受量的1/10～1/3)、长时间连续或高频率(如每周1～3次)的给药模式下，可选择性地显著抑制肿瘤血管生成，且毒性反应小，不易产生耐药，能明显提高病人的生活质量，延长生存期，人们将这种化疗方法命名为低剂量节律(LDM)化疗[1]。顺铂为广谱抗癌药，国外已有用其对胃癌进行LDM化疗的报道，效果较好[2,3]。目前国内尚无该类报道。本文以接种肝癌H22细胞的昆明小鼠为动物模型，观察顺铂LDM化疗对小鼠H22肝癌血管生成的影响及抑瘤效果和毒副作用，初步探讨其对肝癌的治疗价值。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料
   
　　注射用顺铂（冻干型），购自齐鲁制药有限公司。兔抗CD34(工作浓度1∶50)多克隆抗体，购自武汉博士德有限公司。鼠抗VEGF(工作浓度1∶50)、MMP2(工作浓度1∶40)、PCNA单克隆抗体、EDTA抗原修复液、通用型Power VisionTM两步法试剂盒以及DAB显色剂，均购自北京中山金桥公司。SPF级昆明小鼠48只，雄性，5～6周龄，体质量为20～22 g。小鼠肝癌H22细胞,山东省医学科学院药检所提供，以腹水型传代保种，第2代用于实验。

　　1.2  动物模型的建立
   
　　H22细胞小鼠腹腔传代7 d后，无菌抽取腹水(乳白色)2 mL，用3倍无菌生理盐水稀释，4 g/L台盼蓝计数，细胞活力>95%，调细胞浓度至1×1010／L，小鼠右后肢皮肤消毒，皮下接种0.2 mL肿瘤细胞悬液，整个接种过程在无菌操作下1 h内完成。

　　1.3  实验分组及处理
   
　　小鼠接种后24 h随机分为4组，每组12只。对照组：每只小鼠腹腔注射生理盐水0.2 mL/d，每周5次；节律组A：每只小鼠腹腔注射顺铂0.6 mg/(kg·d)，每周5次；节律组B：每只小鼠隔日腹腔注射顺铂1 mg/(kg·d)，每周3次，均持续2周。最大耐受量(MTD)组：每只小鼠一次腹腔注射顺铂9 mg/(kg·d)。每日观察小鼠饮食、活动及一般状况，直至小鼠死亡。

　　1.4  观察项目及方法

　　1.4.1  体质量及瘤体积  接种后5 d起，每3 d测量小鼠体质量、肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，计算肿瘤体积：V(mm3)＝0.523 6 ab2[4]，并绘制小鼠体质量变化曲线及肿瘤生长曲线。

　　1.4.2  瘤质量及抑瘤率  小鼠接种后第15天全部断颈处死，完整剥离皮下瘤结节，用精度为1 mg的天平测定质量，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤质量－实验组瘤质量)／对照组瘤质量×100%。

　　1.4.3  肿瘤大体标本及组织形态观察  肉眼观察肿瘤大体标本，光镜下观察肿瘤组织形态。

　　1.4.4  肿瘤微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达  肿瘤组织经甲醛固定、石蜡包埋后切片，采用免疫组织化学Power VisionTM二步法进行检测，操作步骤按试剂盒要求。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。MVD染色结果判定标准：以CD34单抗标记内皮细胞，凡与邻近的肿瘤细胞、微血管或结缔组织分开的任何胞浆染成棕色的内皮细胞或内皮细胞团，均按独立的微血管分别计数，但肌层较厚，或管腔大于8个红细胞直径的血管不计。MVD计数采用“热点”法，先在低倍镜下扫视整个组织切片，在肿瘤浸润区选择内皮细胞染色清晰、背景良好、微血管最密集的5个视野，然后在400倍镜下计数5个视野内微血管数目，取其平均值。VEGF、MMP2均以胞浆内含有棕黄或棕褐色、颗粒状、定位明确且染色明显的瘤细胞为阳性细胞，MMP2在部分间质细胞也表达。细胞核内出现棕黄色颗粒为PCNA阳性细胞，组织切片先在100倍镜下观察，选取阳性率较高的3个视野，再换成400倍镜，连续计数500个瘤细胞，计算阳性细胞所占百分数。PCNA阳性细胞百分数为PCNA指数。

　　1.5  统计学处理
   
　　所有结果均以均数±标准差表示，数据间比较采用单因素方差分析及SNK法检验。

　　2  结果

　　2.1  顺铂对肿瘤生长的抑制作用
   
　　对照组肿瘤生长曲线较陡直，瘤体持续增长，节律组A、节律组B生长曲线较平缓，肿瘤生长持续缓慢，并位于对照组下方。MTD组肿瘤生长短期内得到控制，生长曲线位于对照组和节律组下方，但2周后迅速回升(图1)。

　　2.2  毒副作用及抑瘤效果
   
　　节律组A、节律组B和对照组小鼠的体质量均逐渐增加，但在后期，对照组小鼠肿瘤负荷较大，体质量有所下降。MTD组体质量则先下降、后逐日缓慢增加(图2)，且在给药后1周内观察到小鼠食欲下降，皮毛失去光泽，行动迟缓，5只小鼠出现血性腹泻。节律组A、节律组B小鼠毛色有光泽，行动灵活，无血性腹泻发生。
   
　　节律组A、节律组B小鼠的瘤质量均明显低于MTD组及对照组，差异有显著意义（F=68.49,q=4.52～19.01,P<0.01），两者的抑瘤率分别高达67.78%、55.56%。见表1。

　　图1  各组肿瘤体积增长曲线（略）

　　图2  各组小鼠体质量变化曲线（略）

　　表1  各组瘤质量及抑瘤率比较（略）

　　与对照组及MTD组相比较，F=68.49,*q=4.52～19.01,P<0.01

　　2.3  皮下移植瘤血管生成情况
   
　　肉眼观察：对照组4只小鼠瘤体表面溃破出血，瘤块假膜不完整，部分浸润生长至腿部肌肉，剥离时出血较多，瘤组织颜色红润、质脆，中心大部分坏死出血；节律组A、节律组B瘤块假膜完整，剥离时基本无出血，瘤组织颜色苍白、质韧，中心也有坏死；MTD组介于两者之间。苏木精伊红染色光镜下观察：对照组呈现灰红色，血管丰富，血管分布以肿瘤的间质及边缘为主；节律组A、节律组B瘤组织出现不同程度的退变，中心及边缘常见灶状或大片状坏死，血管成分较对照组明显减少；MTD组介于两者之间。

　　2.4  免疫组化检测
   
　　由于节律组A、节律组B的各项免疫组化结果相比无明显差别，故将两者合为节律组讨论。节律组的MVD计数、VEGF、MMP2较对照组、MTD组显著减少，差异有显著性(F=9.56、9.38、10.17,q=3.56～6.18,P<0.05)；而MTD组较对照组差异无显著性(q=1.36～2.27,P>0.05)。节律组PCNA指数较对照组降低，但差异无显著意义(F=11.95,q=0.87,P>0.05)；而MTD组较节律组、对照组明显降低，差异有显著意义(q=6.18、6.10,P<0.01)。见表2。 

　　表2  各组免疫组化结果比较（略）

　　3  讨论
   
　　早在1980年，MILLER等通过各种体内外试验发现，几乎所有化疗药物都具有抗肿瘤血管生成作用，常规MTD化疗时血管内皮细胞最先发生凋亡，但较长的间歇期常使已受损的血管系统得以修复。最近，EMMENEGGER等[1]成功发现一种以肿瘤血管内皮细胞为靶点的最新化疗模式，即LDM化疗。目前许多观点支持这一疗法，包括频率越高越好及剂量越小越好。一些学者通过数学模型对这种给药模式进行研究分析，结果表明，机体可通过抑制肿瘤新生血管生长，产生持久的抑瘤效果，比常规MTD化疗可能会更加延长病人的生存时间[5]。 LDM化疗优点为：①内皮细胞遗传性状稳定，不易产生耐药；②所需剂量小，无明显毒副作用；③血管靶向治疗不依赖实体瘤类型，抑瘤谱广；④药物易于到达靶细胞，具有高效性；⑤能与特异性抗血管生成药物合用，提高疗效。
   
　　本研究结果显示，顺铂LDM化疗组肿瘤生长在一段时间内得到控制，处于基本稳定状态，在累积剂量小于MTD组时，最终瘤质量明显低于MTD组及对照组，抑瘤率高达67.78%，且在整个用药期间小鼠毛色有光泽，行动灵活，体质量明显增加。而MTD组在治疗初期抑瘤作用明显，但小鼠体质量明显下降，行动迟缓，5只小鼠出现血性腹泻，在治疗间歇期瘤体积明显增大。由此可以推断，顺铂LDM化疗能持续抑制肿瘤生长，无明显反弹期，且毒副作用小，可长期应用。
   
　　肿瘤的生长和转移是血管依赖性的。MVD能量化反映肿瘤血管生成程度, 是反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数，与肿瘤的侵袭、转移及预后关系密切。而PCNA作为G1/S期合成的核蛋白，在增殖细胞和转化细胞中合成大量增加，与肿瘤细胞增殖状态密切相关。本文免疫组化结果显示，节律组和MTD组肿瘤的MVD计数均有所下降，但节律组下降更明显，与对照组和MTD组相比差异均有显著性，MTD组与对照组相比差异无统计学意义。各组PCNA指数比较，节律组稍低于对照组，差异无显著性；而MTD组较对照组和节律组均显著降低。结合对肿瘤大体标本和光镜下组织学观察，我们可以推断，MTD化疗主要通过抑制肿瘤细胞生长或诱导其死亡而发挥作用；而LDM化疗虽对肿瘤细胞也有轻微的直接作用，但主要通过破坏肿瘤内的血管而致瘤细胞缺血坏死，其抗瘤作用与微血管数目减少有关。其他体内外实验结果也证实低剂量顺铂具有抗血管生成作用，并认为低剂量顺铂无免疫抑制作用，与免疫疫苗联用可产生协同抗瘤作用[6,7]。
   
　　肿瘤血管生成是多种血管生成因子、基质蛋白溶解酶以及黏附分子等参与的多步骤复杂过程。VEGF作为一种最重要的促血管生长因子，通过多种信号通路引起内皮细胞增殖、趋化、迁移，诱导微血管形成，与肿瘤血管生成关系密切[8,9]。基质金属蛋白酶家族在基膜降解、细胞运动和管腔形成中起重要作用，是肿瘤血管生成的关键酶，其中明胶酶A(MMP2)被认为是肿瘤“血管生成开关”的一种调节因子，具有直接促血管生成作用，在肝细胞癌中常过量表达[10]。目前LDM化疗的具体机制不明，一般认为节律化疗可通过直接或间接途径影响肿瘤新生血管内皮细胞的生长或促进凋亡，从而抑制肿瘤血管生成。ALBERTSSON等[11]研究显示，LDM化疗可以通过抑制肿瘤细胞分泌VEGF的表达间接抑制肿瘤血管形成。本文研究结果显示，节律组VEGF、MMP2的表达较对照组和MTD组均显著减少，而且与MVD分布一致。由此我们推测，顺铂LDM化疗的抗肿瘤血管生成作用可能与肿瘤内VEGF、MMP2表达下调有关。
   
　　目前从循证医学的角度看，疗效判定的终点包括生活质量的提高和肿瘤进展时间。本文研究结果提示，节律化疗的突出作用不是迅速消除肿瘤，而是在机体具有较好的生存状况下，通过抗肿瘤血管生成来稳定肿瘤。LDM化疗抗血管生成作用是近来提出的新观点，其前期临床试验具有可行性优势，但目前仍有许多问题需要克服以提高临床用药的成功率。其中观察将来是否会引起细胞DNA遗传变异、继发性肿瘤、淋巴细胞减少等延迟性毒性反应，如何减少不良反应，尚需深入研究。
   
　　总之，随着研究的深入，LDM化疗有望成为晚期肿瘤姑息治疗的一个新选择，通过提高病人的生活质量，使之长期带瘤生存，使那些不易治愈的肿瘤成为可控性疾病。

【参考文献】
  　　[1]EMMENEGGER U, MAN S, SHAKED Y, et al. A comparative analysis of lowdose metronomic cyclophosphamide reveals absent or lowgrade toxicity on tissues highly sensitive to the toxic effects of maximum tolerated dose regimens[J]. Cancer Res, 2004,64(11):39944000.

　　[2]NAKATA B, TSUJI A, HIRAKAWA K. S1+lowdose CDDP[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2006,33(Suppl 1):6874.

　　[3]OHTANI S, SHIMIZU Y, SUGIYAMA S, et al. A case report of advanced gastric cancer with carcinomatous ascites successfully treated by outpatient chemotherapy [J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2007,34(1):8587.

　　[4]RUGGERI B, SINGH J, GINGRICH D, et al. CEP7055: a novel, orally active pan inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase with potent antiangiogenic activity and antitumor efficacy in preclinical models[J]. Cancer Res, 2003,63(18):59785991.

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　　[6]KLEMENT G, HUANG P, MAYER B, et al. Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an antiVEGFR2 antibody in multidrugresistant human breast cancer xenografts[J]. Clin Cancer Res, 2002,8(1):221232.

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　　[8]孙迪文,项锋钢,梁超群. 肺癌VEGF和MMP2的表达与临床病理特征的关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40(1):4446.

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　　[10]王利霞,楼善贤,沈蔚. CD147和MMP2,VEGF在原发性肝癌的表达及意义[J]. 实用肿瘤学杂志, 2005,19(2):109111.
　　
　　[11]ALBERTSSON P, LENNERNAS B, NORRBY K. On metronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGEA[J]. Acta Oncol, 2006,45(2):144155.

作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003