HPV16 E7、TGF β1和MT1MMP在宫颈病变中的表达及其意义

【摘要】  目的 检测宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7蛋白、转化生长因子β1（TGF β1）和膜型基质金属蛋白酶1（MT1MMP）的表达情况，探讨其在宫颈病变形成及演进过程中的意义。方法 应用免疫组织化学SP法检测了64例石蜡包埋的不同病变宫颈组织中HPV16 E7、TGF β1和MT1MMP的表达。结果 在宫颈病变由良性到恶性的发展过程中，TGF β1和MT1MMP的表达水平均逐渐升高（F=501.98、244.22，q=14.81～48.49，P<0.05）；HPV16 E7蛋白阳性组TGF β1和MT1MMP的表达水平均较阴性组高（t=2.76、2.78，P<0.01）；TGF β1与MT1MMP的表达水平呈正相关(r=0.96,P<0.01)。结论 TGF β1和MT1MMP在宫颈病变中的表达与病变良恶性有关，TGF β1和MT1MMP高表达是宫颈恶性肿瘤的表现之一；HPV16感染可能通过HPV16 E7蛋白影响TGF β1和MT1MMP的表达。

【关键词】  宫颈肿瘤 乳头瘤病毒E7蛋白质类 转化生长因子β 间质胶原酶

　　EXPRESSION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 E7, TRANSFORMING GROWTH FACTOR β1 AND MEMBRANE TYPE1 MATRIX METALLOPROTEINASE IN DIFFERERNT STAGES OF HUMAN CERVICAL LESIONS

　　LUAN XIAOTIAN, DAI SHUZHEN

　　Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

　　［ABSTRACT］ Objective To detect the expression of human papillomavirus type 16 E7 protein (HPV16 E7), transforming growth factor β1 (TGF β1) and membrane type1 matrix metalloproteinase (MT1 MMP) in human cervical neoplasms and explore their possible roles in tumor formation and progression. Methods Immunohistochemical staining technique was used to detect the expressions of HPV16 E7, TGF β1 and MT1MMP in 64 paraffin embedded samples of different cervical lesions. Results In the progression from benign to malignant, the expressions of TGF β1 and MT1MMP increased significantly (P<0.05). In HPV16 E7 positive group, the expressions of TGF β1 and MT1MMP were higher than the HPV16 E7 negative group (P<0.01). The association between TGF β1 and MT1MMP expression was significant (r=0.96,P<0.01). Conclusion The expressions of TGF β1 and MT1MMP are related to whether or not the lesion of cervix is malignant,  a higher expression of them is one of the manifestations suggesting of malignancy. HPV16 infection may affect the expression of TGF β1 and MT1MMP through E7 protein.

    ［KEY WORDS］ Cervical neoplasms; Papillomavirus E7 proteins; Transforming growth factor beta; Interstitial collagenase

    宫颈癌是妇女常见的肿瘤，每年全世界大约有37万新发病例，是继乳癌之后居第2位的恶性肿瘤[1]。高危型人类乳头瘤病毒（HPV16、18、33、45等）是公认的宫颈癌的致病因素。然而，只有少数HPV感染的病人发展为宫颈癌，而且需经历从癌前病变到浸润癌的漫长的过程。膜型基质金属蛋白酶1（MT1MMP）在体内生理和病理状态下细胞外基质的重塑过程中发挥重要作用。转化生长因子β（TGF β）在肿瘤中表现为抑制和促进的双重作用，而且参与调节基质金属蛋白酶的表达[2]。本研究以免疫组织化学技术检测石蜡包埋的宫颈癌、宫颈上皮内瘤变（CIN）和慢性宫颈炎组织中HPV16 E7、TGF β1和MT1MMP的表达，探讨HPV感染以及TGF β1和MT1MMP在宫颈病变及其演进过程中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本来源

    收集青岛大学医学院附属医院2005年1月～2006年12月间经手术切除的宫颈组织标本，其中慢性宫颈炎组织10例，CINⅠ9例，CINⅡ9例，CIN Ⅲ 16例，宫颈鳞癌20例。术前均未经放疗或化疗，诊断由两名病理医师证实。所有标本均经40 g/L的甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

　　1.2  检测方法

    采用免疫组织化学SP法。鼠抗人HPV16 E7 单抗（TVG701Y，1∶100）及兔抗人MT1MMP多抗(RB9254,1∶100) 为Lab Vision公司产品；兔抗人TGFβ1多抗（sc146，1∶100）为SantaCruz公司产品。SP试剂盒购自北京中杉金桥公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行，石蜡切片脱蜡，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明封片，显微镜下观察。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

　　1.3  结果观察

    经病理医师证实有抗原表达及定位。在10×40倍光镜下，随机选定5个高倍视野，所得图片用ImagePro Plus 6.0图像分析软件测量抗原TGF β1和MT1MMP在各切片中表达的单位面积积分吸光度。HPV16 E7蛋白的表达定性以有无显色为标准。

　　1.4  统计学分析

    采用SPSS 13.0软件处理实验数据。组间比较采用单因素方差分析和t检验。TGF β1和MT1MMP表达的相关性采用直线相关分析。

　　2  结 果

　　2.1  HPV16 E7在不同阶段宫颈病变中的表达

    HPV16 E7蛋白表达于复层鳞状上皮的细胞核和细胞浆，在慢性宫颈炎和各级CIN中主要在增生旺盛的基底细胞和棘细胞层表达，在宫颈癌组织内则呈弥漫性表达。HPV16 E7蛋白在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌中的阳性表达率依次为：40.0％（4/10）、44.4%(4/9)、55.6%(5/9)、56.2%(9/16)、70.0%(14/20)。HPV16 E7蛋白在不同阶段宫颈病变中总感染率为56.2%。

　　2.2  TGF β1在不同阶段宫颈病变中的表达

    TGF β1可表达于正常宫颈鳞状上皮细胞、癌细胞、间质成纤维细胞和部分淋巴细胞的胞浆，间质也可显色。在慢性宫颈炎组织中主要在增生旺盛的基底细胞和棘细胞层表达，在宫颈癌组织内呈弥漫性表达。TGF β1表达水平在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ等3组之间差异无显著性（F=501.98，q=0.78～2.46，P>0.05）,在CIN Ⅲ组的表达水平与其他各组比较差异均有显著性（q=13.38～36.70，P<0.05），在宫颈鳞癌组的表达水平与其他各组比较差异均有显著性（q=36.70～48.49，P<0.05）。随着宫颈病变的进展，TGF β1的表达水平呈增高趋势。见表1。

　　2.3  MT1MMP在不同阶段宫颈病变中的表达

    MT1MMP表达于细胞膜和细胞浆，在慢性宫颈炎和各级CIN中主要在增生旺盛的基底细胞和棘细胞层表达，在宫颈癌组织内则呈弥漫性表达。MT1MMP表达水平在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ等3组之间差异无显著性（F=244.22，q=1.05～2.83，P>0.05）,在CIN Ⅲ组的表达水平与其他各组比较差异均有显著意义（q=14.81～18.58，P<0.05），在宫颈癌组的表达水平与其他各组比较差异均有显著性（q=17.12～34.03，P<0.05）。随着宫颈病变的进展，MT1MMP的表达水平也呈增高趋势。见表1。 表1  TGF β1和MT1MMP在不同阶段宫颈病变中的表达(略)

　　2.4  HPV16 E7蛋白对TGF β1、MT1MMP表达的影响

    HPV16 E7蛋白阳性和阴性组间比较，TGF β1和MT1MMP的表达差异均有显著意义(t=2.76、2.78,P<0.01)。见表2。 表2  HPV16 E7蛋白对TGF β1、MT1MMP表达的影响（略）

　　2.5  TGF β1和MT1MMP表达的相关性
    TGF β1在宫颈病变中的表达与MT1MMP呈正相关（r=0.96,P<0.01）。 

　　3  讨 论

    HPV是公认的宫颈癌的致病因素，在已确认的宫颈癌病例中大约90％～100％可检测到HPV DNA[3]。DNA序列分析发现HPV有200多个基因型, HPV16和HPV18 是宫颈癌中最常见型别,其次是HPV58、 HPV52 和HPV56。国际癌症研究协会(IARC) 对已发表85份研究中的10 058例宫颈癌病例进行分析, 发现超过2/3 的宫颈癌病例与HPV16(51.0%) 或HPV18(16.2%) 感染有关[4]。不同种类HPV与宫颈癌的组织学分型及临床分期有关, HPV16多见于宫颈鳞癌，HPV18多见于宫颈腺癌[5]。HPV E7原癌基因是HPV诱发宫颈癌的主要机制之一，它的产物HPV E7原癌蛋白与抑癌蛋白pRb结合，诱导后者的降解，导致上皮细胞永生化, 使细胞生长增殖失控及细胞凋亡异常。此外，HPV E7原癌蛋白可与细胞周期相关因子结合导致细胞分裂周期紊乱，同时也可以使端粒酶延长，促进细胞的永生化[6,7]。本研究结果显示，HPV16 E7原癌蛋白在不同阶段宫颈病变中总感染率为56.2%，在宫颈鳞癌中尤其高，达70.0%，与以往研究结果相符，验证了HPV16 E7在宫颈癌变过程中起关键作用。

    TGFβ是一种多功能的多肽类细胞生长因子，几乎体内的所有细胞都能产生TGFβ并存在其受体。在哺乳动物体内TGFβ有3种亚型：TGF β1、TGFβ2和TGFβ3，三者生物学作用相似，以TGF β1含量最高。TGF β1在多种肿瘤中表达增高，近年研究发现,TGFβ对肿瘤表现为两种不同甚至截然相反的作用:在肿瘤的早期阶段,由于其引起生长周期阻断的作用,它可作为肿瘤抑制物抑制肿瘤的生长;在肿瘤进展的过程中,TGFβ可由肿瘤细胞和(或)其周围的基质细胞产生,且TGFβ对肿瘤细胞的抑制增殖作用降低或消失，从而使肿瘤细胞出现优势生长;在肿瘤生长的晚期阶段,TGFβ作为肿瘤的促进因子,通过刺激血管生成、促进细胞播散、抑制免疫细胞及合成细胞外基质等促进肿瘤的生长、浸润及转移[8,9]。

    在宫颈癌中TGF β1的表达以及HPV E7对TGF β1的调节作用尚存在争议。ELSHERIF[10]报道，在CIN中TGF β1 mRNA的表达水平比正常宫颈明显下降，TGF β1 mRNA的表达水平从CINⅠ到CINⅢ 逐渐下降，提示TGFβ抑制上皮细胞的增殖。但是，PERALTAZARAGOZA 等[11]的研究结果显示，HPV16 E6、E7可激活TGF β1 的启动子，上调TGF β1 的表达。本研究结果显示，TGF β1在宫颈病变由良性到恶性的过程中表达水平逐渐升高，且在HPV16 E7阳性组表达水平较阴性组高，这与PERALTAZARAGOZA等的报道一致，提示TGF β1高表达是宫颈恶性肿瘤的表现之一，HPV16 E7可能通过对TGF β1表达的调控机制促进宫颈癌变的过程。

    基质金属蛋白酶（MMPs)是一组锌依赖性内肽酶，参与细胞外基质降解和肿瘤新生血管形成，与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关[12]。大多MMPs是以可溶性酶原形式存在，但MMPs也可通过Ⅰ型跨膜区、GPI或Ⅱ型跨膜区与细胞膜相连。MT1MMP是膜型MMP的典型成员，与细胞的多种生理、病理过程相关。MT1MMP可直接降解细胞外基质成分，包括Ⅰ型和Ⅱ型胶原、纤维连接蛋白、层连接蛋白、纤维蛋白和多种蛋白多糖。而且MT1MMP可以和TIMP2及MMP2酶原形成复合体，促进MMP2酶原的活化。除此之外，MT1MMP还有广泛的作用底物，包括CD44、αV整合素、tTG、LRP、IL8等[13]。SOUNNI等[14]发现MT1MMP可以在转录水平调节血管内皮细胞生长因子的表达。SABEH等[15]报道，MT1MMP具有独立的不依赖于纤溶酶原、明胶酶A、TIMP2、明胶酶B、胶原蛋白酶3和基质降解酶的侵袭作用，认为MT1MMP是主要的细胞相关的蛋白水解酶，在正常或肿瘤细胞侵袭活动中是必需的。

    本研究结果显示，MT1MMP在宫颈病变由良性到恶性的过程中表达水平逐渐升高。鉴于MT1MMP在肿瘤细胞侵袭活动的强大作用，提示MT1MMP可能是宫颈癌前病变获得浸润和转移能力最终转化为浸润癌的关键的蛋白水解酶，可能在宫颈癌变过程中也是必需的。本研究结果同时显示，在HPV16 E7阳性组MT1MMP的表达水平较阴性组高。AKGUL[16]已经报道，在皮肤器官模型培养中皮肤高危型HPV8 E7能够使人类角质化细胞获得侵袭真皮层的能力，同时也可检测到MMP1、MMP8和MT1MMP表达水平增高。所以，可以推测高危型HPV16 E7癌蛋白可能也参与了宫颈癌变过程中MT1MMP表达的调控。

    本研究结果显示，TGF β1在宫颈病变中的表达与MT1MMP呈正相关，提示TGF β1可能参与了MT1MMP表达的调控。孙建平等[17]研究表明，在高血压进展过程中TGF β1早期表达,并上调MMP9的表达,两者协同作用促进动脉硬化、小动脉玻璃样变及血管重塑过程。MUNSHI等[2]报道，TGF β1 可通过ERK1/2 和p38 MAPK途径提高MT1MMP和MMP2的表达。因此，在宫颈癌中可能也存在这一TGF β1对MT1MMP的调控机制。综合上述结果可推测，HPV16 E7有可能通过TGF β1途径调节MT1MMP的表达，促进浸润前癌到浸润癌的恶性转化。

【参考文献】
  　　[1]PARKIN D M, PISANI P, FERLAY J. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 1999,49:3364.

　　[2]MUNSHI H G, WU Y I, MUKHOPADHYAY S, et al. Differential regulation of membrane type 1matrix metalloproteinase activity by ERK 1/2 and p38 MAPKmodulated tissue inhibitor of metalloproteinases2 expression controls transforming growth factorbeta1induced pericellular collagenolysis[J]. J Biol Chem, 2004,279(37):3904239050.

　　[3]BOSCH F X, LORINCZ A, MUNOZ N, et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer[J]. J Clin Pathol, 2002,55(4):244265.

　　[4]FRANCESCHI S. The IARC commitment to cancer prevention: the example of papillomavirus and cervical cancer[J]. Recent Results Cancer Res, 2005,166:277297.

　　[5]ALTEKRUSE S F, LACEY J V J R, BRINTON L A, et al. Comparison of human papillomavirus genotypes, sexual, and reproductive risk factors of cervical adenocarcinoma and squamous cell carcinoma: Northeastern United States[J]. Am J Obstet Gynecol, 2003,188(3):657663.

　　[6]BURD E M. Human papillomavirus and cervical cancer[J]. Clin Microbiol Rev, 2003,16(1):117.

　　[7]MUNGER K, BALDWIN A, EDWARDS K M, et al. Mechanisms of human papillomavirusinduced oncogenesis[J]. J Virol, 2004, 78(21):1145111460.

　　[8]DERYNCK R, AKHURST R J, BALMAIN A. TGFbeta singnaling in tumor suppression and cancer progression[J]. Nat Genet, 2001,29:117129.

　　[9]ELLIOTT R L, BLOBE G C. Role of transforming growth factor beta in human cancer [J]. J Clin Oncol, 2005, 23(9):20782093.

　　[10]ELSHERIF A M. Decreased synthesis and expression of transforming growth factor beta in HPV 16 positive cervical cancer: a study by microdissection quantitative RTPCR and immunocytochemistry[J]. J Pathol, 2000,192(4):494501.

　　[11]PERALTAZARAGOZA O, BERMUDEZMORALES V, GUTIERREZXICOTENCATL L, et al. E6 and E7 oncoproteins from human papillomavirus type 16 induce activation of human transforming growth factor beta1 promoter throughout Sp1 recognition sequence[J]. Viral Immunol, 2006,19(3):468480.

　　[12]NOEL A, MAILLARD C, ROCKS N, et al. Membrane associated proteases and their inhibitors in tumour angiogenesis[J]. J Clin Pathol, 2004,57(6):577584.

　　[13]ZHAI Y, HOTARY K B, NAN B, et al. Expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase is assoceated with cervical carcinoma progression and invasion[J]. Cancer Res, 2005,65(15):65436450.

　　[14]SOUNNI N E, DEVY L, HAJITOU A. MT1MMP expression promotes tumor growth and angiogenesis through an upregulation of vascular endothelial growth factor expression[J]. FASEB J, 2002,16(6):555564.

　　[15]SABEH F, OTA I, HOLMBECK K, et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membraneanchored collagenase MT1MMP[J]. J Cell Biol, 2004,167(4):769781.

　　[16]AKGUL B. The E7 protein of cutaneous human papillomavirus type 8 causes invasion of human keratinocytes into the dermis in organotypic cultures of skin[J]. Cancer Res, 2005,65(6):22162225.

　　[17]孙建平,刑广群,于宁,等. 高血压肾小动脉硬化病人外周血单个核细胞中MMP9及TGFβ1 mRNA的表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40(4):316318.

作者单位：青岛大学医学院附属医院妇产科，山东 青岛 266003