间皮素mRNA与子宫内膜癌的相关性研究

【摘要】  目的 研究间皮素mRNA的表达与子宫内膜癌的相关性。方法 采用半定量RTPCR技术检测41例子宫内膜癌组织和14例正常子宫内膜组织中间皮素mRNA的表达情况。结果 间皮素mRNA在子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中的表达率分别为82.9％（34/41）、78.6％（11/14），相对含量分别为0.75±0.22、0.54±0.09，子宫内膜癌组织间皮素mRNA相对含量高于正常子宫内膜组织（t=2.949,P<0.05）。手术病理分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、深肌层浸润及低分化组的子宫内膜癌间皮素mRNA相对含量分别高于手术病理分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、浅肌层浸润及高中分化组（t=2.204～3.971,P<0.05）。结论 间皮素mRNA的过表达与子宫内膜癌的浸润、转移有相关性，检测其表达有助于子宫内膜癌恶性程度的判断和预后的估计。

【关键词】  子宫内膜肿瘤 间皮素 逆转录聚合酶链反应

　　A CORRELATED STUDY OF MESOTHELIN mRNA AND ENDOMETRIAL CARCINOMA

　　ZHANG MINWEI, DAI SHUZHEN, BI SHUNA, et al

　　Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the relationship between the expression of mesothelin mRNA and endometrial carcinoma.  Methods The semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) was used to examine the expression of mesothelin mRNA in 41 cases of endometrial carcinoma and 14 cases of normal endometrium.  Results The mesothelin mRNA expression in carcinoma and normal endometrium  was 82.9% and 78.6%, respectively. The relative contents of mesothelin mRNA were 0.75±0.22 and 0.54±0.09, respectively, and the level in endometrial carcinoma was significantly higher than that in normal endometrium (P<0.05). The relative contents of mesothelin mRNA in endometrial carcinoma of surgical pathologic staging Ⅲ-Ⅳ with lymphatic metastasis, deep myometrium invasion and poor differentiation were significantly higher than those of surgical pathologic staging Ⅰ-Ⅱ without lymphatic metastasis, with superficial myometrium invasion and well differentiation (P<0.05). Conclusion The overexpression of mesothelin mRNA is related to invasion and metastasis of endometrial cancer, the detection of which is conducive to the judgement of its malignancy and predicition of its prognosis.

    ［KEY WORDS］ Endometrial neoplasms; Mesothelin; Reverse transcriptase polymerase chain reaction

    间皮素是一种肿瘤相关的以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞表面的糖蛋白。其功能目前尚不清楚，CHANG等[1]推测间皮素与细胞的黏附有关，可能与肿瘤的浸润转移关系密切。本研究通过检测间皮素mRNA在子宫内膜癌组织中的表达，寻找其在子宫内膜癌中表达的规律，探讨其与子宫内膜癌发生、发展的关系。

　　1  对象与方法

　　1.1  研究对象

    2004年9月～2005年11月，选择我院收治的子宫内膜癌病人41例，术前均未经任何治疗，也无其他系统恶性肿瘤，年龄39～76岁，平均为57岁。按国际妇产科联盟（FIGO）2000年手术病理分期标准，Ⅰ、Ⅱ期 28 例，Ⅲ、Ⅳ期 13 例。按WHO组织病理学分级标准，G1级7例，G2级24 例，G3级10例。有淋巴结转移6例；伴有深肌层浸润20例。选择正常子宫内膜组织(取自同期因子宫肌瘤行手术治疗的病人)14例作对照。标本采集后，立即置于液氮中冷冻，然后转入-70 ℃冰箱中备用。所有诊断均经病理检查证实。

　　1.2  检测方法

    组织总RNA提取：按Trizol（美国Invitrogen公司产品）试剂盒说明书进行操作，提取标本组织中的总RNA。引物合成：从GenBank中查到间皮素mRNA基因序列，按照引物设计原则，用Priner Premier 4.0软件设计。间皮素引物序列为：上游引物5′TTGGCACAGAAGAATGTCAAGCT3′，下游引物5′TCCACATTGGCCTTCGTGA3′，扩增产物的长度为185 bp。内参照采用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）：上游引物5′CTTAGCACCCCTGGCCAAG3′，下游引物5′GATGTTCTGGAGAGCCCCG3′，扩增产物的长度为150 bp。以上引物由上海生工生物工程公司合成。RTPCR反应： 按照一步法RTPCR试剂盒（QIAGEN公司）说明书操作，直接合成目的基因产物。25 μL反应体系含5×Buffer 5 μL，5×QSolution 5 μL，dNTP Mix 1 μL,QIAGEN One Step RTPCR Enzyme Mix 1 μL,间皮素基因引物GAPDH引物0.6 μmol/L，模板RNA 2～5 μL。RTPCR反应条件为：逆转录50 ℃ 30 min,95 ℃预变性15 min;然后94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，扩增40个循环；最后72 ℃延伸10 min。

　　1.3  结果观察

    RTPCR产物在含有溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，电泳条带图像用FluorS MultiImager成像仪扫描后，应用Quantity One软件包（BioRad公司）测定电泳分离的各特异扩增条带灰度值，以间皮素 mRNA与GAPDH的灰度值的比值作为间皮素 mRNA的相对表达量进行分析。

　　1.4  统计学处理

    应用SPSS 14.0软件包进行统计学处理。间皮素mRNA阳性表达率采用χ2检验或Fisher’s精确概率法分析，相对含量比较采用方差分析或t检验。

　　2  结果

　　2.1  间皮素在两组子宫内膜组织中的表达

    间皮素 mRNA在子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中的表达率分别为82.9％和78.6％，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。间皮素 mRNA相对含量两组分别为0.75±0.22和0.54±0.09，子宫内膜癌组高于正常子宫内膜组，差异有统计学意义(t=2.949,P<0.05)。见图1。

　　2.2  间皮素 mRNA与子宫内膜癌临床病理特征的关系

    间皮素 mRNA的表达率与子宫内膜癌的手术病理分期、组织学分级、有无淋巴结转移以及肌层浸润深度无关（P>0.05）。手术病理分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、深肌层浸润组及组织学分级低分化组的相对含量分别高于Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、浅肌层浸润组及高中分化组，差异有统计学意义(t=2.204～3.971，P<0.05)。见表1。表1  间皮素mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征关系（略）
　　3  讨论

    间皮素是一个能被单克隆抗体K1识别的特异性的抗原[1]。CHANG 等[2]从能与单克隆抗体K1发生反应的Hela细胞系的基因文库中提取cDNA克隆出这一特异性抗原的基因，因该基因编码产生的膜结合蛋白主要位于正常间皮细胞表面，故将其命名为间皮素。间皮素的cDNA编码产生一个相对分子质量为6.9万的前体蛋白。该前体蛋白包含有628个氨基酸及4个隐藏的能与氨基端相连的糖蛋白位点，且在第288～293位氨基酸处还存在一个furin分离位点。当该前体蛋白的羧基末端的疏水性序列被磷脂酰肌醇取代，并且它的一个或多个糖蛋白位点上结合有糖蛋白时，该前体蛋白即被furin分离产生一个相对分子质量为4.0万的片段和一个小的相对分子质量为
　　
　　3.2万的片段。前者即间皮素，以GPI锚定于细胞表面。

    在人体正常组织中，间皮素局限分布于间皮细胞，有研究提示在气管、扁桃体、输卵管和肾脏也有少量间皮素表达[3]。而在人类恶性肿瘤中，间皮素在卵巢癌、胰腺癌和恶性间皮瘤等中有高表达[3～9]。目前，间皮素的生物学功能尚不够清楚。CHANG等[2]的研究提示间皮素与细胞的黏附有关，高表达间皮素的细胞的黏附特性发生了改变。他们发现转染间皮素的细胞较对照组细胞有更强的黏附力，推测间皮素可能与细胞的黏附有关，由于间皮素是位于细胞表面的糖蛋白，其可能在细胞的分子识别和（或）支持中起作用，或作为细胞信号的受体。

    目前的研究显示，间皮素与肿瘤的发生、转移关系密切。本研究应用半定量RTPCR方法检测间皮素mRNA在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的表达水平的差异。结果显示，尽管在子宫内膜癌组与正常子宫内膜组的间皮素mRNA的表达阳性率无明显差别，但两组间皮素mRNA的相对含量差异存在显著性（P<0.05），即正常子宫内膜组织虽也有间皮素的表达，但含量较低。有研究提示，GPI相关蛋白与酪氨酸激酶的活动有关[11,12]。间皮素作为GPI相关糖蛋白之一，其也可能与酪氨酸激酶的活动有关，乐志培等[13]认为，酪氨酸激酶与细胞生长、繁殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转变的关键环节，故推测间皮素可能与肿瘤的发生有关。另外，PRIEVE等[10]报道某些Wnt信号转导通道活动的信号因子能明显调整间皮素基因的表达增多，而Wnt信号转导通道是癌症重要的特异性信号通道之一，在人类肿瘤基因起源和多样的发展过程方面起重要作用。间皮素是以GPI锚定于细胞表面的糖蛋白，可能在某些Wnt信号转导通道活动中作为细胞信号的受体，参与细胞发生恶性转化的过程。总之，子宫内膜癌组织间皮素的高表达可能提示间皮素在子宫内膜癌的发生中有作用，但其具体作用机制，还有待进一步研究阐明。

    恶性肿瘤一个重要生物学特征是其对邻近正常组织的浸润及远处转移。目前已知肿瘤的浸润和转移与其黏附分子表达的改变有关。癌细胞与癌细胞、血管内皮细胞及细胞外基质的黏附和解离在肿瘤的转移扩散中起着决定的作用。已有许多研究发现，癌细胞在原发灶增殖、侵入转移位点并增殖的一系列过程中所涉及的细胞细胞、细胞基质间的相互作用可能由特异性的黏附分子介导。本研究在不同的手术病理分期和组织学分级中分析间皮素mRNA表达的异同显示：间皮素mRNA在低分化子宫内膜腺癌组的表达水平高于高、中分化子宫内膜腺癌组；间皮素mRNA在Ⅲ～Ⅳ期组织中的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期组织中的表达水平。子宫内膜癌的手术病理分期的Ⅲ～Ⅳ期表明癌组织不局限于子宫，已侵犯到了附件、阴道、膀胱、直肠、盆腔淋巴结等周围器官。间皮素与细胞的黏附有关，则其有可能在这一过程中发挥作用，使有其高表达的肿瘤细胞黏附力增强而易于形成癌转移灶，从而在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥作用。本研究结果还显示，间皮素mRNA在深肌层浸润的子宫内膜癌组中的表达水平明显高于浅肌层浸润组；其在有淋巴结转移的子宫内膜癌组中的表达水平也明显高于无淋巴结转移组。由此推测，间皮素与子宫内膜癌手术病理分期、组织学分级、浸润和转移有关。但是，间皮素作用的分子机制目前尚不清楚，还有待进一步研究。

    淋巴结转移是子宫内膜癌最重要的预后因素，而子宫内膜癌的宫外转移与肿瘤的复发关系密切。由于临床分期和组织学分级均是判断病人预后的重要因素,故临床分期越晚,组织分化越差,病人预后越差[14]，故手术病理分期显示了子宫内膜癌的高危情况，对于评价该疾病的复发和生存率有重要作用。而间皮素mRNA在临床期别晚、组织学分级差的子宫内膜癌组织中的表达水平高，提示间皮素mRNA检测可能对子宫内膜癌预后评价有意义。

    综上所述，间皮素mRNA在子宫内膜癌组织中的表达的测定表明它可能与子宫内膜癌的发生、发展有关，与子宫内膜癌的手术病理分期、组织学分级有关，与子宫内膜癌的恶性程度和预后有关。所以，对间皮素表达检测可能在评价子宫内膜癌恶性程度和预后的判断等方面具有一定的临床意义。

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作者单位：青岛大学医学院附属医院妇产科，山东 青岛 266003