介入栓塞化疗对局部晚期宫颈癌组织VEGF表达及

【摘要】  目的 探讨介入栓塞化疗对宫颈癌血管内皮生长因子（VEGF）及微血管密度(MVD)的影响及其临床意义。方法 应用RTPCR方法测定47例局部晚期宫颈癌病人介入栓塞化疗前后癌组织中VEGF表达,并进行MVD计数，评定化疗近期效果。结果 介入栓塞化疗的总有效率80.9%，ⅠB2期、ⅡA期、ⅡB期宫颈癌介入化疗效果无明显差异（P>0.05）；ⅢA期及ⅢB期宫颈癌介入治疗效果无明显差异（P>0.05），且治疗有效率明显低于前3组（χ2=3.98～6.11,P<0.05）。治疗前局部晚期宫颈癌组织中VEGF的表达与肿瘤的临床分期、淋巴结转移、病理类型、组织学分级均明显相关（t=2.4、3.0,F=5.62、7.12,P<0.05）；介入治疗后高分化宫颈癌及无淋巴结转移的宫颈癌中VEGF表达无明显下降(P>0.05); 不同临床分期、有淋巴结转移、不同病理类型及中、低分化的局部晚期宫颈癌介入治疗后VEGF表达均较治疗前明显降低(t=1.84～13.20，P<0.05) ；介入栓塞化疗后MVD计数明显降低(t=21.92～53.51,P<0.01)。结论 术前介入栓塞化疗能降低宫颈癌组织VEGF的表达,减少MVD计数,能减小肿瘤体积，提高手术切除率，是一种可行、有效的辅助治疗手段。

【关键词】  子宫颈癌 介入治疗 血管内皮生长因子 微血管密度

　　INFLUENCE OF INTERVENTIONAL CHEMOTHERAPY ON THE EXPRESSIONS OF VEGF AND MVD IN LOCALLY ADVANCED CERVICAL CANCER

　　MO PING, MA DEHUA, ZHAO SHUPING

　　Department of Gynecology and Obstetrics, The affiliated Qingdao Hiserve Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266033, China

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of interventional chemotherapy through artery on the expressions of VEGF and MVD in locally advanced cervical cancer (LACC). Methods The expression of VEGF mRNA was detected by RTPCR and MVD evaluated in the tissues of 47 LACC patients. The effectiveness was assessed. Results The total effective rate  was 80.9%. There was no significant difference in effective rate between ⅠB2/ⅡA and ⅡB (P>0.05), nor was between ⅢA and ⅢB (P>0.05). But the effective rate in ⅢA and ⅢB group was lower than in ⅠB2/ⅡA and ⅡB group (χ2=3.98-6.11,P<0.05). The levels of  VEGF mRNA expression was significantly associated with the clinical stage, lymph node metastasis, pathological type and histological gade (t=2.4,3.0;F=5.62,7.12;P<0.05). After chemotherapy, there was no significant change of  VEGFmRNA expression  in highlydifferentiated cancer and cancer without lymph node metastasis. But the expressions of VEGF and MVD in LACC with different clinical stages, lymph node metastasis, and different types of pathology, the moderately  and poorly differentiated cancer were significantly reduced after the treatment (t=21.92-53.51,P<0.01). Conclusion Preoperative  interventional chemotherapy can effectively reduce the expressions of VEGF and MVD. It can reduce  tumor size  and increase the rate of complete surgical removal of the tumor, which is a feasible and effective treatment for locally advanced cervical cancer.

    ［KEY WORDS］ Cervical neoplasms; Interventional chemotherapy; Vascular endothelial growth factor; Microvessel density

    局部晚期宫颈癌（LACC）是指一组具有不良预后因素的高危宫颈癌，此类宫颈癌单纯手术或放疗不易控制，容易发生淋巴转移或远处转移，预后差[1]。近年来兴起的血管介入栓塞化疗具有局部化疗浓度高，毒副反应小等优点，为部分晚期宫颈癌病人提供手术机会。但是目前介入栓塞化疗效果判断均是根据临床症状和体征，准确性不够理想。 血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤，血管内皮生长因子(VEGF)是一重要的促血管生长因子;在许多肿瘤中微血管密度（MVD）被认为是判断肿瘤进展和转移能力的指标。本文采用RTPCR方法测定VEGF在局部晚期宫颈癌化疗前后表达情况，并进行MVD计数，结合化疗效果，探讨VEGF及MVD与宫颈癌治疗效果的关系，以及宫颈癌介入栓塞化疗的有效性及可行性。现将结果报告如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料

    2004年12月～2007年12月,选择青岛大学医学院附属医院行动脉灌注化疗的47例局部晚期宫颈癌病人为研究对象。年龄25～67岁，中位年龄46岁。按照FIGO(2000)宫颈癌临床分期，ⅠB2期15例， ⅡA期11例，ⅡB期9例，ⅢA期7例， ⅢB期5例，其中鳞癌34例，腺癌13例；组织学分级：低分化10例、中分化23例、高分化14例；所有病人均经病理证实，临床资料完整。所选病人均行动脉灌注化疗2次，末次化疗后4周根据病人情况选择手术或放疗方式，留取化疗前和不能手术的放疗前活检标本及手术切除的肿瘤边缘生长活跃宫颈癌标本适量，-70 ℃冰箱保存待用。

　　1.2  主要试剂和仪器

    RNA提取试剂盒Trizol Reagant为美国Gibco公司产品，引物由上海生物化工有限公司合成，RTPCR试剂盒QIAGEN OneStep RTPCR Kit为德国QIAGEN公司产品。

　　1.3  方法

　　1.3.1  动脉介入栓塞化疗 

　　用Seldinger技术，将5 F Cobra导管选择性插入髂内动脉后，先行动脉造影，以了解血管分布及肿瘤动脉供血及侧支循环等情况，分别灌注稀释后的DDP 40 mg、BLM 15～20 mg,氟尿嘧啶500 mg，再超选择至子宫动脉及肿瘤血管，用明胶海绵条3～4条进行栓塞，栓塞后造影见肿瘤血管基本消失为止。同法对侧髂内动脉注入等量化疗药物，化疗药物总量DDP 80 mg, BLM 30～40 mg, 氟尿嘧啶1 000 mg，拔管后加压包扎穿刺部位，平卧24 h，21 d后重复第2疗程。

　　1.3.2  总RNA的提取
 
　　取50～100 mg的标本，应用Trizol Reagant试剂盒说明书提取组织RNA。

　　1.3.3  RTPCR反应 

　　取0.18 μg的总RNA，在50 μL体系中扩增，按照QIAGEN OneStep RTPCR Kit说明书进行操作，VEGF引物序列 primer 1: 5′GGATGTCTATCAGCGCAGCAC3′,primer 2:5′TCACCGCCTCGGCTRGTCACATC3′，VEGF产物长度454 bp；反应条件：50 ℃，30 min；94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；共35个循环。内参照GAPDH的引物序列 primer 1: 5 ′ACTGCCACCCAGAAGACT3′，primer 2: 5′GCTCAGTGTAGCCCAGGAT3′，GAPDH产物长292 bp。GAPDH反应条件：50 ℃，30 min；95 ℃，15 min;94 ℃，1 min;62 ℃，1 min;72 ℃，1 min;共27个循环。

　　1.3.4  RTPCR半定量分析 

　　取3 μL PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，采用自动电泳凝胶成像分析仪及分析软件进行图像扫描和分析，将 VEGF与GAPDH的PCR产物电泳条带扫描灰度值相比，其比值为VEGF基因表达数值并进行半定量分析。

　　1.3.5  介入治疗效果判定标准 

　　根据WHO标准，完全缓解(CR)：肿瘤完全消失并维持4周以上;部分缓解(PR)：肿瘤缩小50%以上并维持4周以上;稳定(SD)：肿瘤缩小或增大不超过25%,且无新病灶出现;进展(PD)：肿瘤增大超过25%,出现新病灶。介入治疗后CR+PR为有效，SD+PD为无效。

　　1.4  MVD的计数方法

    根据文献[2]的方法,首先在低倍镜下(40倍)扫描,寻找肿瘤内血管染色清楚且微血管最多的区域,然后在200倍镜下计数肿瘤内的毛细血管和小静脉数。任何呈棕黄色且与邻近血管、肿瘤细胞和其他结缔组织成分清楚分开的阳性内皮细胞或内皮细胞簇为一个能够计数的微血管,因为计数微血管的方法在不同观察者之间或观察者本人存在差异,所以不同的时间计数3次,选择两次相同或相近数目的平均数。

　　1.5  统计学处理

    应用SPSS 11.5统计学软件，非参数统计采用χ2检验，参数统计两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结 果

　　2.1  介入治疗的临床疗效

    局部晚期宫颈癌介入栓塞化疗的总有效率80.9%，经统计学分析显示ⅠB2期、ⅡA期、ⅡB期宫颈癌介入化疗效果无明显差异（P>0.05）;ⅢA期及ⅢB期宫颈癌介入化疗效果无明显差异（P>0.05），但其有效率明显低于前3组（χ2=3.98～6.11,P<0.05）。47例局部晚期宫颈癌病人经两疗程介入治疗后均达到止血、止痛、缩小包块体积的近期疗效，症状缓解率为100.0%。39例宫颈癌经栓塞介入治疗后降低临床分期，获得手术机会，7例病人介入治疗后仍无手术机会，辅以放射治疗。见表1。表1  宫颈癌介入化疗疗效观察（略）

　　2.2  宫颈癌介入治疗前后VEGF的表达

    治疗前局部晚期宫颈癌组织中VEGF的表达与肿瘤的临床分期、淋巴结转移、病理类型、组织学分级均明显相关（t=2.4、3.0,F=5.62、7.12,P<0.05）；高分化宫颈癌及术后病理证实无淋巴结转移的宫颈癌血管栓塞介入治疗前后VEGF表达无明显差异(P>0.05); 不同临床分期、有淋巴结转移、不同病理类型及中低分化的局部晚期宫颈癌介入治疗后VEGF表达均明显降低(t=1.84～13.20，P<0.05)。见表2。表2  宫颈癌介入治疗前后VEGF的表达（略）

　　2.3  介入化疗前后宫颈癌组织中MVD计数情况
   
　　介入化疗后MVD计数明显下降,前后相比有显著性差异(t=21.92～53.51,P<0.01);下降幅度随着病期的升高而呈增大趋势,但差异无显著意义。见表3。表3  动脉灌注化疗栓塞前后MVD计数情况（路）

　　3  讨论

　　3.1  血管内皮生长因子在局部晚期宫颈癌中的表达及临床意义

    局部晚期宫颈癌是一组具有不良预后因素的高危宫颈癌，广义包括宫颈癌ⅠB2～ⅣA期，狭义指局部肿瘤直径≥4 cm的早期巨块型宫颈癌。随着LACC病人的增多及病人对治疗后生存质量要求的提高，传统的治疗模式对局部晚期宫颈癌治疗效果并不理想，长期存活率不超过40％，复发者的存活率则更低，不超过30％[3]。主要原因是局部复发和远处转移。血管生成在实体肿瘤的进展、转移中起重要作用，当肿瘤直径≥1～2 mm时即有血管生成以维持肿瘤的生长，肿瘤细胞亦可经血管进入血液循环发生血行转移。近年研究表明，VEGF及其家族成员在血管生成过程中起着重要作用，并与多种肿瘤的复发转移及预后密切相关[4]。FUJIMOTO等[5]报道，在早期浸润宫颈癌组织有高水平VEGF mRNA表达，且除了ⅣB期外其他的各个阶段均与VEGF mRNA水平有关，认为VEGF在宫颈癌早期浸润中起重要作用。

    本研究显示，VEGF在局部晚期宫颈癌中的表达与肿瘤的临床分期有关，随着临床期别的进展，VEGF表达增高，提示VEGF可能参与宫颈癌血管生成的正性调节，有助于其对血管高渗作用的维持，并能增加肿瘤血管的通透性，增加宫颈癌发生转移的机会，从而促进宫颈癌恶性程度的增加。因此，VEGF在晚期宫颈癌浸润、转移中可能也起重要作用。本研究结果还显示，VEGF在局部晚期宫颈腺癌中的表达明显高于宫颈鳞癌中的表达，有淋巴结转移的宫颈癌中高于无淋巴结者，提示VEGF可能是宫颈腺癌易于转移及预后不良的危险因素之一，VEGF的表达可能反映肿瘤的负荷和肿瘤进展的程度，与肿瘤的转移、分期及预后密切相关。

　　3.2  MVD与肿瘤

    肿瘤血管的生成对原发肿瘤的生长和转移具有重要的意义。一方面为肿瘤的生长提供营养物质,另一方面为肿瘤的转移提供必备的条件。在许多肿瘤中MVD被认为是判断肿瘤进展和转移能力的指标,与肿瘤的分化程度密切相关,也是影响病人生存的独立预后因素。MVD计数越高,预后越差。本研究结果与此相符。

　　3.3  术前介入栓塞化疗对局部晚期宫颈癌的疗效及意义

    宫颈癌系局部进展型肿瘤，血供主要来源于双侧子宫动脉，髂内动脉其余脏支可能参与供血，而且原发灶与部分转移灶集中在盆腔，这为宫颈癌的介入治疗提供了理想的血管解剖学基础。介入治疗可将介入导管插到肿瘤的供血动脉后再用药物，盆腔药物浓度可为全身化疗的80多倍，而局部肿瘤药物浓度增加1倍，杀伤肿瘤细胞的能力提高10～100倍[6]，同时加上栓塞术对宫颈癌引起的出血和包块等起到治疗作用，使已经转移到盆腔淋巴系统和盆腔微小血管内癌细胞得以清除[7]。对于具有手术指征但癌组织分化不良的宫颈癌病人术前动脉化疗可使癌组织分化降级并可杀灭癌组织周围微小转移灶，提高存活率[8]，为病人争取手术机会，是目前最精确的动脉化疗方法[9]。

    本文结果显示，ⅢA期及ⅢB期宫颈癌介入治疗效果与其他各组比较明显降低，考虑可能与阴道下部及盆壁病变部位存在髂内动脉以外的侧支循环，或者临床分期越晚癌性新生血管越丰富有关，这与NAGATA等[10]提出临床分期是预测疗效的独立因素部分相符。

　　3.4  介入栓塞化疗对局部晚期宫颈癌VEGF表达及MVD的影响

    在宫颈癌介入化疗的疗效评估方面，目前均是根据对临床症状及体征变化的观察判断，如阴道流血减少，局部包块缩小[11]。我们对局部晚期宫颈癌介入治疗前后VEGF的表达进行测定，结果表明，介入化疗后VEGF的表达整体降低。介入栓塞化疗可以降低宫颈癌临床分期，改善临床症状，提示宫颈癌的介入化疗可能通过杀死肿瘤细胞，减少肿瘤细胞分泌VEGF，从而减少肿瘤血管的生成，减少肿瘤细胞的氧供及营养，进一步促进肿瘤细胞凋亡或进入休眠状态，缩小原发肿瘤的体积，使宫旁及阴道局部病灶消失，为根治性手术创造条件。术前介入化疗还可防止肿瘤细胞从新生血管中逸出并转移到其他器官，降低宫颈癌恶性程度，从而提高治疗效果和改善预后。本实验显示，介入化疗对无淋巴结转移的宫颈癌和高分化宫颈癌的VEGF的表达影响无统计学意义，考虑可能是由于此两种类型宫颈癌介入前VEGF的表达即处于低水平的原因，进一步提示VEGF可反映宫颈癌淋巴结转移、恶性程度及侵袭能力。

    MVD与膀胱癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤的浸润生长、转移及预后密切相关。本研究显示, 介入栓塞化疗后MVD计数下降,说明肿瘤组织内的血管减少,肿瘤生长受限,甚至因缺血低氧而使肿瘤坏死,达到肿瘤消失或缩小的目的,为手术创造条件,这与临床结果相符;另一方面MVD计数下降,提示肿瘤的分化程度有一定程度提高,恶性潜能下降,转移、侵袭能力减弱,减少转移使生存期限明显提高。一些学者研究发现肿瘤内微血管密度与动脉化疗的疗效呈正相关,认为MVD计数可用来预测动脉化疗的疗效[12],同时也认为MVD与肿瘤的分化程度呈负相关[13]。

    总之，VEGF和MVD有望成为反映宫颈癌淋巴转移、治疗效果及判断预后的良好指标。术前介入栓塞化疗对局部晚期宫颈癌有较好的近期疗效，从血管生成方面提示，介入栓塞化疗是局部晚期宫颈癌的一种可行、有效的辅助治疗手段。

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作者单位：青岛大学医学院附属青岛市海慈医院妇产科，山东 青岛 266033