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【摘要】 目的 探讨细胞周期蛋白（CyclinD1）、细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（P27）在胃癌组织表达及其意义。方法 应用组织微阵列技术结合免疫组织化学方法(PV9000法)检测CyclinD1、P27在正常胃黏膜、癌旁组织及胃癌组织中的表达。结果 正常胃黏膜、癌旁组织及胃癌组织中CyclinD1的表达率分别为17.6％、32.7％、65.5％，P27的表达率分别为61.9％、23.9％、13.3％，三组间CyclinD1、P27的表达率比较差异有显著性（H=54.35、46.92，P<0.01）。CyclinD1、P27在肿瘤中的表达呈负相关(r=-0.209，P<0.05)。CyclinD1过表达和P27表达下降与胃癌浸润程度和淋巴结转移有关(χ2=4.86～9.04，P<0.05)。结论 CyclinD1过表达和P27表达下降在胃癌的发展过程中起重要作用，对早期预测癌细胞的转移潜能、判断胃癌预后有重要的临床意义。
【关键词】 胃肿瘤 细胞周期蛋白D1 细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白 芯片分析技术 免疫组织化学
EXPRESSION OF CyclinD1 AND P27 AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE IN GASTRIC CARCINOMA
GAO HAN, YU JIANXIAN
Department of Pathology, The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China
［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression of CyclinD1 and P27 in gastric cancer and their clinical significance.Methods The expression of CyclinD1 and P27 were determinded in normal gastric tissue, the adjacent cancer tissue and gastric cancer with the immunohistochemistry and tissue microarry technique. Results In normal gastric tissue, the adjacent cancer tissue and gastric cancer, positive immuostaining of cyclinD1 were 17.6%, 32.7%, 65.5%, respectively; While positive immuostaining of P27 were 61.9%, 23.9%, 13.3%, respectively. The expressions of CyclinD1 and P27 were significantly different between the three tissues (H=54.35，46.92；P<0.01). Expression of CyclinD1 was negatively correlated with expression of P27 (r=-0.209,P<0.05). The high expression of CyclinD1 and the low expression of P27 were correlated with depth of invasion and lymph node metastasis (χ2=4.86-9.04,P<0.05). Conclusion The results suggest that high expression of CyclinD1 and low expression of P27 may play an important role in the development of gastric cancer and be related to the prognosis of the disease. Tissue microarry is an efficient, low consume and strong comparability technique in the study of human pathology.
［KEY WORDS］ Stomach neoplasms; Cyclin D1; Cyclindependent kinase inhibitor P27; Microchip analytical procedures; Immunohistochemistry
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居各类癌症死亡的第一位。肿瘤的浸润转移是病人死亡的主要原因，也是判断病人预后的重要指标。组织微阵列(TMA)又称组织芯片，它可将数十、数百甚至上千个微小的不同临床组织集成到一张载玻片上制成有序的微缩组织切片，从而在一次实验中即可获得大量结果。我们采用组织微阵列技术制作胃癌的组织微阵列并用免疫组织化学技术进行细胞周期蛋白CyclinD1（CyclinD1）和细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白(P27)的检测，探讨胃癌组织中CyclinD1、P27的表达及意义。
1 材料与方法
1.1 材料
标本取自2000～2007年间本院手术切除且资料完整的原发性胃癌113例。所有病人术前均未接受过放疗和化疗。癌旁组织取自于距肿瘤病灶约1.5～2.0 cm处，正常胃黏膜取自距肿瘤10 cm以外的部位。组织学分型：高、中分化腺癌65例，低、未分化腺癌48例；浸润深度：未浸及浆膜层37例，浸及浆膜及浆膜外76例；发生淋巴结转移87例，无淋巴结转移26例。
1.2 组织微阵列制备
载玻片经过清洁液浸泡，充分水洗并烘干，用体积分数0.01的多聚赖氨酸处理载玻片，烘干备用。将熔化石蜡制作 4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm 大小的空白蜡块。设计9×7点组织列阵，使用打孔仪制成模块。对供体组织苏木精伊红染色（HE）切片作形态学观察并在供体蜡块上准确标记所需要的靶点。利用打孔仪钻取靶点组织，然后转移至受体蜡块相应的孔位上，即制成所需的阵列蜡块，取样针直径1.5 mm，共制作2个组织芯片蜡块。已制备好的组织微阵列蜡块连续4 μm厚切片，裱贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，置37 ℃恒温箱12 h，常温保存备用。各取1张进行HE染色供形态学观察。
1.3 组织微阵列免疫组化标记
采用非生物素化辣根酶标记免疫组织化学染色法(PV9000)。CyclinD1单克隆抗体、P27单克隆抗体及PV9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。主要染色步骤参照试剂盒说明书进行，抗原修复均采用微波修复法。以已知阳性片作阳性对照，以同种动物非免疫血清代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定
综合细胞染色强度和阳性细胞计数进行半定量分析，判断标准见文献[1]：①按细胞显色有无和深浅计分如下：无显色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分；②按显色细胞的比例计分如下：显色细胞比例<10%计0分，10%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～100%计3分。以两者计分的和作为判断标准：0分阴性(-)，1～4分低表达(+)，>4分高表达()。
1.5 统计学处理
所有数据均用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。
2 结 果
2.1 正常胃黏膜、癌旁组织和胃癌组织中CyclinD1和P27的表达
CyclinD1在正常胃黏膜表达极低(17.6%)，且多为低表达；在癌旁组织中表达率升高（32.7%）；在胃癌组织中表达显著升高(65.5%)，且多为高表达。三组间比较有显著性差异(H=54.35，P<0.01)。P27在正常胃黏膜组织表达最高（61.9%），在癌旁组织和胃癌组织中表达明显降低（分别为23.9%和13.3%），三组之间比较有显著性差异(H=46.92，P<0.01)。见表1。表1 CyclinD1和P27在正常胃黏膜、癌旁组织和胃癌中的表达（略）
2.2 不同临床病理因素胃癌组织中CyclinD1和P27表达的比较
CyclinD1和P27的表达与胃癌的组织分化程度无显著关系(P>0.05)，与胃癌浸润深度和有无淋巴结转移显著相关(χ2=4.86～9.04，P<0.05)。见表2。表2 CyclinD1和P27的表达与临床病理参数的关系（略）
2.3 CyclinD1和P27的相关分析
CyclinD1和P27在胃癌组织中的表达呈负相关(r=-0.209，P<0.05)。见表3。表3 CyclinD1和P27表达的关系（略）
3 讨 论
应用组织微阵列一次实验即可获得大量结果，具有高效、快速、低消耗的特点，而且对一次实验所获结果进行平行分析，可比性强，结果更具标准化。我们通过组织芯片技术对113例胃癌组织进行CyclinD1和P27的免疫组化检测，结果仅用几张切片即完成了全部实验，且染色背景清晰，很少出现边缘现象。极大节约了研究经费、降低了制作成本及劳动量，而且在最短的时间内获得了CyclinD1和P27在胃癌组织中表达的全部数据。
CyclinD1是一种细胞周期蛋白，在细胞增殖调节中起重要作用，已被证实在众多人类恶性肿瘤的发生发展中担当重要角色[2]。某些原癌基因如Ras基因可与CyclinD1相互作用，以促进细胞的转化，过量CyclinD1可导致细胞失去对生长因子的依赖，以致发生恶变[3]。本实验结果显示，CyclinD1在胃癌组织的阳性表达率显著高于癌旁组织和正常组织，且随肿瘤浸润深度的增加和淋巴结转移的出现，CyclinD1阳性表达增强，提示CyclinD1在胃癌的恶性演进过程中可能发挥重要作用。
P27为重要的细胞周期抑制蛋白，通过多种方式参与细胞周期的调控，其最终结果是抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞分化，在肿瘤发生过程中起重要作用[4]。P27通过与CDK或cyclinCDK复合物的结合，实现对CDK活性的抑制，从而对细胞周期进行负调控。它既能抑制已与cycin结合并已激活的CDK，又能抑制CDK的激活过程。本研究显示，P27在胃癌组织中的表达率明显低于癌旁组织和正常组织。P27表达下降可能是由于逐渐增加的蛋白酶所介导的降解作用增强所致，而非基因突变，P27蛋白水平的调节主要发生于转录之后的翻译和降解过程。P27蛋白水平低下或缺失，其对细胞增殖抑制作用相应下降，可导致细胞过度增殖,引起肿瘤发生[5]。有学者报道，P27表达与多种肿瘤的病理参数有关，与肿瘤的预后呈正相关性[6]。本研究结果显示，随肿瘤浸润深度的增加，P27阳性表达降低，当有淋巴结转移时，P27表达也显著降低，说明P27的失活与胃癌的发展密切相关。
CyclinD1和P27均为重要的细胞周期的调控蛋白，CyclinD1与cdk4结合可催化Rb蛋白磷酸化，释放核转录因子E2F，促进细胞周期。而P27可抑制CyclinD1cdk4的活性，从而抑制细胞周期。本研究显示,在胃腺癌组织中P27和CyclinD1呈反向表达，也提示两者存在相互抑制倾向。
综上所述，胃癌组织中CyclinD1和P27的表达可能成为预测该肿瘤的生物学行为和判断病人预后的指标。
【参考文献】
[1]ZHAO J G, WU A G, HUANG Z H, et al. Expression of P27 and its clinical significance in colorectal carcinoma[J]. Ger J Clin Oncal, 2002,1(3):129131.
[2]FU M, WANG C, LI Z, et al. CyclinD1: normal and abnormal functions[J]. Endocrinology, 2004,145(8):54395447.
[3]KONG S, AMOS C I, LUTHRA R, et al. Effects of cyclinD1 polymorphism on age of onset of hereditary nonpolyposis colorectal cancer[J]. Cancer Res, 2000,60(2):249252.
[4]MYUNG N, KIM M R, CHUNG I P, et al. Loss of P16 and P27 is associated with progression of human gastric cancer[J]. Cancer Lett, 2000,153(1/2):129136.
[5]KIM D H, LEE H I, NAM E S, et al. Reduced expression of the cell cyclin inhibitor p27Kip1 is associated with progression and lymph node metastasis of gastric carcinoma[J]. Histopathology, 2000,36(3):245251.
[6]SUI L, DONG Y, OHNO M, et al. Implication of malignancy and prognosis of p27(kip1), CyclinE, and Cdk2 expression in epithelial ovarian tumors[J]. Gynecol Oncol, 2001,83(1): 5663.
作者单位：青岛大学医学院附属青岛市市立医院病理科,山东 青岛 266071