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首页医源资料库在线期刊齐鲁医学杂志2008年第23卷第3期

照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用影响

来源:《齐鲁医学杂志》
摘要:【摘要】目的模拟调强适形放射治疗(IMRT)模式,观察照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用的影响及凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax表达的变化。方法荷LEWIS肺癌的C57BL/6雄性小鼠40只,随机分成假照组、常规照射组(A组)及IMRT模拟组(B1组、B2组)。按设计要求对各个照射剂量点进行照射,每个剂量点分5次......

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【摘要】  目的 模拟调强适形放射治疗(IMRT)模式,观察照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用的影响及凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax表达的变化。方法 荷LEWIS肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只,随机分成假照组、常规照射组(A组)及IMRT模拟组(B1组、B2组)。按设计要求对各个照射剂量点进行照射,每个剂量点分5 次照射,其间分别间隔7.0、10.5 min,照射后取出肿瘤,用末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数,并采用免疫组化技术检测凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax的表达水平。结果 各组凋亡指数的差别有显著性(F=161.54,P<0.01),其中假照组的凋亡指数最低,A组的凋亡指数最高。各组间Bcl2蛋白的半定量测定结果比较差别有统计学意义(F=737.40,P<0.01),其中假照组的Bcl2蛋白含量最高,A组的含量最低。各组Bax蛋白的半定量测定结果比较差别有统计学意义(F=161.45,P<0.01),其中假照组的Bax蛋白含量最低。结论 在一定的范围内,随着照射时间延长,小鼠LEWIS肺癌细胞Bax表达降低,而Bcl2表达升高,凋亡指数下降。照射时间延长可导致高能X线对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用降低。

【关键词】  放射疗法 适形 肺肿瘤 细胞凋亡 凋亡相关蛋白

  IMPACT OF PROLONGED RADIATION ON LEWIS LUNG CANCER CELLS IN MICE

  LI XIAOLI, LIU XIGUANG, CHENG XIGUO, et al

  Cancer Center, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao  266003, China

  [ABSTRACT] Objective To investigate the effects of prolonged fraction dosedelivery time on LEWIS lung cancer cell apoptosis in mice. Methods LEWIS lungcancer models were set up with C57BL/6 in 40 male mice, which were randomly divided into four groups: shamirradiated group, conventional radiotherapy group (group A), two IMRT mimicking groups (group B1, group B2) with different prolonged fraction delivery time for five times in 7.0and 10.5min interval, and the tumours were then removed, the changes of apoptosis index (AI) and  level of Bcl2 were detected Using  TUNEL and immunohistochemical staining.Results The differences of apoptosis index between different groups were statistically significant (P<0.01). In shamirradiated group, apoptosis index was the lowest, while in group A, the apoptosis index was the highest. Differences of the expression of Bcl2 protein between different groups had statistical significance (P<0.01). In shamirradiated group, the expression of Bcl2 protein was the lowest.  Conclusion In definite extent, with the prolongation of irradiatation, the expression of Bax in LEWIS cells declines, of Bcl2 rises, and apoptosis decreases. Prolonged radiation may lead to decrease of killing efficiency of highenergy xray for LEWIS lung cells in mice.

    [KEY WORDS] Radiotherapy, computerassisted; Lung neoplasms; Apoptosis; Apoptosisassociated protein

    放射疗法已成为肿瘤综合治疗的主要手段之一[1,2],进入20世纪90年代以来,由于多叶准直器(MLC)  和计算机控制技术的发展和成熟,使得KIJEWSKI等[3]最初在20世纪70 年代提出的调强适形放射治疗(IMRT) 在临床应用获得了可能性。由于IMRT可在提高肿瘤靶区剂量分布的同时使关键组织保持低剂量分布[4],因此在临床上得到了广泛应用。然而在IMRT中,为达到物理剂量分布的适形性要求,物理师会根据具体情况设置若干子野,在照射实施过程中,这些子野的照射是分步进行的,既有先后顺序又有不同的强度,这样做的结果是使某一既定照射剂量的完成时间延长。FLORIAN[5]将临床IMRT计划和常规放疗计划设计在假体上,结果显示剂量率可能直接影响IMRT的有效性[6,7]。本实验模拟IMRT照射模式,观察照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用的影响及凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax表达的变化,初步探讨其可能的机制。现报告如下。

  1  材料和方法

  1.1  动物和瘤株

    C57BL/6 小鼠50只,清洁级,4~6周龄,雄性,体质量18~22 g,由中国医学科学院实验动物研究所提供。荷有LEWIS肺癌的C57BL/6小鼠由中科院实验动物研究所提供。小鼠购进后在我院医学动物实验中心饲养。饲养条件为:室温22~ 28 ℃, 相对湿度40%~70%, 标准颗粒饲料喂养。

  1.2  主要试剂和仪器

    Bcl2鼠单克隆抗体和Bax鼠单克隆抗体由美国Santa Cruz Biotechnology公司提供。羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗及DAB显色液购自北京中衫金桥生物技术有限公司。原位凋亡细胞检测试剂盒MK1020(POD)购自Roche公司。Varian 3EX408高能直线加速器和LeicaDMR4000B图像处理系统由我院肿瘤中心提供。

  1.3  实验方法

  1.3.1  荷瘤小鼠模型的制备 

  将种鼠断颈处死后, 在无菌条件下分离出生长良好的肿瘤组织, 用生理盐水洗净血性物后, 用天平称质量。剪碎后按1 g肿瘤组织加入3 mL生理盐水的比例, 经研磨成均浆后200目筛网过滤,用生理盐水稀释制成2.8×109/L瘤细胞悬液,将0.2 ml/L的瘤细胞悬液接种到健康小鼠右腹股沟皮下。接种后1 周左右, 肿瘤体积为(0.65±0.01)cm3, 随机分组进行实验[8]。

  1.3.2  实验分组 

  将荷LEWIS肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只随机分成4个组,每组10只:包括假照组,常规照射组(A组)和IMRT模拟组(B1组、B2组)。

  1.3.3  照射及检测方法 

  将小鼠(包括假照组小鼠)用100 g/L的水合氯醛(350 mg/kg)经腹腔麻醉后, 用胶布固定在实验板上,记号笔标出小鼠肿瘤体表定位,在瘤体上放1 cm厚凡士林纱布补偿,使用美国Varian 23EX408高能直线加速器产生的6 MVX 线垂直照射靶区,源皮距(SSD)为100 cm,剂量率为6 Gy/min,照射野均为2.0 cm×2.0 cm,总照射剂量15 Gy,小鼠均在清醒状态下照射。A组分3次照射,照射的间隔时间1.7 min,总时间6 min; B1组:分5次照射,照射间隔时间 7.0 min,总时间30 min; B2组:分5次照射,照射间隔时间10.5 min,总时间45 min;各组照射剂量同常规照射组。照射后的小鼠根据分组情况,用小鼠笼携回动物房喂养,照射24 h后全部小鼠脱颈处死,取出肿瘤迅速用40 g/L中性甲醛固定, 常规脱水、透明、包埋, 石蜡切片,每例标本做3张连续石蜡切片,用末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数(AI),并用免疫组化法检测凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax的水平。

  1.3.4  结果判定及统计学处理 

  细胞凋亡的阳性细胞为细胞核染色,呈棕褐色;阴性细胞无核染色或浅染。计数方法:在光镜下随机选取5个高倍视野(400倍) 作为观察区,计算5个视野内阳性细胞数占总细胞数百分率的平均值,作为单个标本的AI。Bcl2染色阳性信号为胞浆内、核膜上出现棕黄色颗粒, Bax阳性反应颗粒分布于胞浆内,为棕黄色。每张免疫组化片随机取上、中、下、左、右5 个高倍视野,用LEICADMR4000B图像处理系统测其积分吸光度(IA)并取均值,以IA反映Bax、Bcl2蛋白表达情况。所有数据均用±s表示。采用SPSS 13.0 for Windows 统计软件包进行统计分析。

  2  结果

  2.1  TUNEL检测

    各组细胞AI比较差异有显著性(F=161.54,P<0.01),其中,A组的AI最高,随着照射时间的延长,凋亡指数下降。假照组与各照射组比较,差别有极显著性(q=7.16~29.81,P<0.01); B1、B2组与A组比较,凋亡指数降低,差别有极显著性(q=18.12、22.65,P<0.01);B2组的凋亡指数比B1组低,但差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

  2.2  凋亡相关蛋白Bcl2的半定量测定

    假照组细胞的胞浆、核膜出现较多棕黄色颗粒,各组凋亡相关蛋白Bcl2表达水平差别有极显著统计学意义(F=737.40,P<0.01)。其中A组的Bcl2蛋白含量最低,假照组的最高。B1组、B2组与A组比较,Bcl2蛋白含量增高,差别有统计学意义(q=42.99、52.99,P<0.01); B2组与B1组、B2与假照组之间比较,差别无统计学意义(P>0.05)。随着照射时间延长,Bcl2蛋白的表达呈上升的趋势。见表1。

  2.3  凋亡相关蛋白Bax的半定量测定

    A组的细胞胞浆中出现较多的黄色颗粒,其次是B1、B2组,染色最淡的是假照组。 各组凋亡相关蛋白Bax的表达水平比较,差别有统计学意义(F=161.45,P<0.01)。其中假照组的Bax蛋白含量最低,A组的最高。各照射组与假照组比较,Bax蛋白含量均增高,差别有高度统计学意义(q=9.34~29.58,P<0.01);B1组、B2组与A组比较,Bax蛋白含量降低,差别有高度统计学意义(q=10.61、20.24,P<0.01);B2组较B1组Bax蛋白含量低,差别有统计学意义 (q=9.63,P<0.05)。见表1。表1  各组小鼠LEWIS肺癌组织细胞的AI、Bcl2及Bax比较(略)

  3  讨 论

    在传统的放疗中,2 Gy的剂量采用3野照射总的实施时间约6 min,而采用静态调强放疗,完成1次肿瘤量为2 Gy的照射需要20~30 min甚至更长,明显长于常规治疗所需的时间。由于机器的输出量不变,单位时间内组织的吸收剂量降低,按照经典放射生物学理论中的剂量率效应(即当剂量率下降时会增加组织和细胞对射线的抵抗性),这会导致肿瘤控制率下降,使生物效应明显下降[9]。BENEDICT等[10]结果表明,用6 MV的X线照射人恶性胶质瘤细胞,将总的照射剂量分成相等的分割,实施时间16 min~3 h。给予相同的剂量,随着总照射时间的增加,细胞存活率提高。本实验通过测定不同照射时间小鼠LEWIS肺癌组织的凋亡指数,结果与上述报道一致,当照射时间延长时,凋亡指数明显下降,放射效应降低。

    Bcl2是典型的凋亡抑制基因,而Bax是促凋亡基因[11]。目前认为Bax表达过量, 自身可形成Bax 同源二聚体,作为线粒体膜上离子通道的组成成分,使细胞色素C 得以穿过线粒体膜,并在细胞质内参与形成凋亡启动复合体,直接启动或诱导细胞凋亡连锁,从而促进细胞凋亡;Bcl2的过度表达可以与Bax竞争结合,形成BaxBcl2异二聚体,封闭Bax 形成孔道的活性,阻止细胞色素C穿过线粒体膜进入细胞质,从而发挥抑制细胞凋亡作用[12,13]。本实验显示,当照射时间从6 min延长至30 min时,Bax表达下降,Bcl2表达增加;当照射时间延长至45 min时,Bax表达更低,Bcl2表达明显增加。上述二者的变化与各组凋亡指数的变化方向一致,即LEWIS肺癌细胞凋亡指数降低时,Bax表达减少,而Bcl2表达增加。照射时间延长诱导LEWIS肺癌细胞凋亡指数下降,可能是通过调节Bax 及Bcl2的表达实现的。

    总之,IMRT在物理学上的优势是显而易见的[14],但是延长了相同剂量的照射完成时间,降低了相对剂量率,杀灭细胞的生物效应比常规照射有所下降, 因此,临床实施IMRT时应考虑到照射时间延长、相对剂量率降低这一因素对疗效的影响,可在分次及总剂量上予以适当补偿。

【参考文献】
    [1]殷尉伯,田凤华. 2001年全国放射治疗人员及设备调查报告[J]. 中华放射肿瘤学杂志, 2002,11(3):145147.

  [2]LAUGIER A. Radiotherapy in France[J]. Radiother Oncol, 1997,43(Suppl 2):34.

  [3]KIJEWSKI P K,CHIN L M, BJARNGARD B E. Wedgeshaped dose distributions by computercontrolled collimator motion[J]. Med Phys, 1978,5(3):426429.

  [4]刘阳. 三维适形放射治疗中的物理学与生物学[J]. 实用肿瘤学志, 2006,20(4):350352.

  [5]FLORIAN S. Radiobiological investigation of doserate effects in intensitymodulated radiation therapy[J]. Strahlentherapyund Onkologie, 2005(1):4248.

  [6]FOWLER J F. Loss of biological effect in prolonged fraction delivery[J]. Int J Radia Oncol Biol Phys, 2004,59(1):242249.

  [7]GALVIN J M. Implementing IMRT in clinical practice: a joint document of American society for therapeutic radiology and oncology and American association of physicists in medicine[J]. Int J Radia Oncol BiolPhys, 2004,58(5):16161634.

  [8]冯林春,王所亭,陈国雄,等. 低氧条件下照射小鼠Lewis肺癌实体瘤的实验研究[J]. 军医进修学院学报, 2000,21(1):2325.

  [9]王鑫,何少琴. 精确放疗所面对的生物学问题[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2006,13(10):101104.

  [10]BENEDICT S H, LIN P S, ZWICKER R D, et al. The biological effectiveness of intermittent irradiation as a function of overall treatment time: development of correction factors for linacbased stereotactic radiot herapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1997,37(4):765769.

  [11]刘伟,于文成,秦筱梅. 非小细胞肺癌Bcl2及Bax蛋白的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(2):149153.

  [12]CHENG E H, WEI M C, WEILER S, et al. Bcl2, Bclx (L) sequester BH3 domain only molecules preventing BAX and BAK mediated mitochondrial apoptosis[J]. Mol Cell, 2001,8(3):705711.

  [13]刘陶文. 凋亡调控基因BCL2 家族研究的新进展[J]. 生物化学与生物物理进展, 1999,26(3):216219.

  [14]王旬果,孙福銮,王建军. 三维适形放射法治疗非小细胞肺癌的效果[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(2):112114.


作者单位:青岛大学医学院附属医院肿瘤治疗研究中心,山东 青岛 266003

作者: 李晓丽
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