点击显示 收起
【摘要】 目的 模拟调强适形放射治疗(IMRT)模式,观察照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用的影响及凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax表达的变化。方法 荷LEWIS肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只,随机分成假照组、常规照射组(A组)及IMRT模拟组(B1组、B2组)。按设计要求对各个照射剂量点进行照射,每个剂量点分5 次照射,其间分别间隔7.0、10.5 min,照射后取出肿瘤,用末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数,并采用免疫组化技术检测凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax的表达水平。结果 各组凋亡指数的差别有显著性(F=161.54,P<0.01),其中假照组的凋亡指数最低,A组的凋亡指数最高。各组间Bcl2蛋白的半定量测定结果比较差别有统计学意义(F=737.40,P<0.01),其中假照组的Bcl2蛋白含量最高,A组的含量最低。各组Bax蛋白的半定量测定结果比较差别有统计学意义(F=161.45,P<0.01),其中假照组的Bax蛋白含量最低。结论 在一定的范围内,随着照射时间延长,小鼠LEWIS肺癌细胞Bax表达降低,而Bcl2表达升高,凋亡指数下降。照射时间延长可导致高能X线对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用降低。
【关键词】 放射疗法 适形 肺肿瘤 细胞凋亡 凋亡相关蛋白
IMPACT OF PROLONGED RADIATION ON LEWIS LUNG CANCER CELLS IN MICE
LI XIAOLI, LIU XIGUANG, CHENG XIGUO, et al
Cancer Center, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China
[ABSTRACT] Objective To investigate the effects of prolonged fraction dosedelivery time on LEWIS lung cancer cell apoptosis in mice. Methods LEWIS lungcancer models were set up with C57BL/6 in 40 male mice, which were randomly divided into four groups: shamirradiated group, conventional radiotherapy group (group A), two IMRT mimicking groups (group B1, group B2) with different prolonged fraction delivery time for five times in 7.0and 10.5min interval, and the tumours were then removed, the changes of apoptosis index (AI) and level of Bcl2 were detected Using TUNEL and immunohistochemical staining.Results The differences of apoptosis index between different groups were statistically significant (P<0.01). In shamirradiated group, apoptosis index was the lowest, while in group A, the apoptosis index was the highest. Differences of the expression of Bcl2 protein between different groups had statistical significance (P<0.01). In shamirradiated group, the expression of Bcl2 protein was the lowest. Conclusion In definite extent, with the prolongation of irradiatation, the expression of Bax in LEWIS cells declines, of Bcl2 rises, and apoptosis decreases. Prolonged radiation may lead to decrease of killing efficiency of highenergy xray for LEWIS lung cells in mice.
[KEY WORDS] Radiotherapy, computerassisted; Lung neoplasms; Apoptosis; Apoptosisassociated protein
放射疗法已成为肿瘤综合治疗的主要手段之一[1,2],进入20世纪90年代以来,由于多叶准直器(MLC) 和计算机控制技术的发展和成熟,使得KIJEWSKI等[3]最初在20世纪70 年代提出的调强适形放射治疗(IMRT) 在临床应用获得了可能性。由于IMRT可在提高肿瘤靶区剂量分布的同时使关键组织保持低剂量分布[4],因此在临床上得到了广泛应用。然而在IMRT中,为达到物理剂量分布的适形性要求,物理师会根据具体情况设置若干子野,在照射实施过程中,这些子野的照射是分步进行的,既有先后顺序又有不同的强度,这样做的结果是使某一既定照射剂量的完成时间延长。FLORIAN[5]将临床IMRT计划和常规放疗计划设计在假体上,结果显示剂量率可能直接影响IMRT的有效性[6,7]。本实验模拟IMRT照射模式,观察照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用的影响及凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax表达的变化,初步探讨其可能的机制。现报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物和瘤株
C57BL/6 小鼠50只,清洁级,4~6周龄,雄性,体质量18~22 g,由中国医学科学院实验动物研究所提供。荷有LEWIS肺癌的C57BL/6小鼠由中科院实验动物研究所提供。小鼠购进后在我院医学动物实验中心饲养。饲养条件为:室温22~ 28 ℃, 相对湿度40%~70%, 标准颗粒饲料喂养。
1.2 主要试剂和仪器
Bcl2鼠单克隆抗体和Bax鼠单克隆抗体由美国Santa Cruz Biotechnology公司提供。羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗及DAB显色液购自北京中衫金桥生物技术有限公司。原位凋亡细胞检测试剂盒MK1020(POD)购自Roche公司。Varian 3EX408高能直线加速器和LeicaDMR4000B图像处理系统由我院肿瘤中心提供。
1.3 实验方法
1.3.1 荷瘤小鼠模型的制备
将种鼠断颈处死后, 在无菌条件下分离出生长良好的肿瘤组织, 用生理盐水洗净血性物后, 用天平称质量。剪碎后按1 g肿瘤组织加入3 mL生理盐水的比例, 经研磨成均浆后200目筛网过滤,用生理盐水稀释制成2.8×109/L瘤细胞悬液,将0.2 ml/L的瘤细胞悬液接种到健康小鼠右腹股沟皮下。接种后1 周左右, 肿瘤体积为(0.65±0.01)cm3, 随机分组进行实验[8]。
1.3.2 实验分组
将荷LEWIS肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只随机分成4个组,每组10只:包括假照组,常规照射组(A组)和IMRT模拟组(B1组、B2组)。
1.3.3 照射及检测方法
将小鼠(包括假照组小鼠)用100 g/L的水合氯醛(350 mg/kg)经腹腔麻醉后, 用胶布固定在实验板上,记号笔标出小鼠肿瘤体表定位,在瘤体上放1 cm厚凡士林纱布补偿,使用美国Varian 23EX408高能直线加速器产生的6 MVX 线垂直照射靶区,源皮距(SSD)为100 cm,剂量率为6 Gy/min,照射野均为2.0 cm×2.0 cm,总照射剂量15 Gy,小鼠均在清醒状态下照射。A组分3次照射,照射的间隔时间1.7 min,总时间6 min; B1组:分5次照射,照射间隔时间 7.0 min,总时间30 min; B2组:分5次照射,照射间隔时间10.5 min,总时间45 min;各组照射剂量同常规照射组。照射后的小鼠根据分组情况,用小鼠笼携回动物房喂养,照射24 h后全部小鼠脱颈处死,取出肿瘤迅速用40 g/L中性甲醛固定, 常规脱水、透明、包埋, 石蜡切片,每例标本做3张连续石蜡切片,用末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数(AI),并用免疫组化法检测凋亡相关基因蛋白Bcl2、Bax的水平。
1.3.4 结果判定及统计学处理
细胞凋亡的阳性细胞为细胞核染色,呈棕褐色;阴性细胞无核染色或浅染。计数方法:在光镜下随机选取5个高倍视野(400倍) 作为观察区,计算5个视野内阳性细胞数占总细胞数百分率的平均值,作为单个标本的AI。Bcl2染色阳性信号为胞浆内、核膜上出现棕黄色颗粒, Bax阳性反应颗粒分布于胞浆内,为棕黄色。每张免疫组化片随机取上、中、下、左、右5 个高倍视野,用LEICADMR4000B图像处理系统测其积分吸光度(IA)并取均值,以IA反映Bax、Bcl2蛋白表达情况。所有数据均用±s表示。采用SPSS 13.0 for Windows 统计软件包进行统计分析。
2 结果
2.1 TUNEL检测
各组细胞AI比较差异有显著性(F=161.54,P<0.01),其中,A组的AI最高,随着照射时间的延长,凋亡指数下降。假照组与各照射组比较,差别有极显著性(q=7.16~29.81,P<0.01); B1、B2组与A组比较,凋亡指数降低,差别有极显著性(q=18.12、22.65,P<0.01);B2组的凋亡指数比B1组低,但差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 凋亡相关蛋白Bcl2的半定量测定
假照组细胞的胞浆、核膜出现较多棕黄色颗粒,各组凋亡相关蛋白Bcl2表达水平差别有极显著统计学意义(F=737.40,P<0.01)。其中A组的Bcl2蛋白含量最低,假照组的最高。B1组、B2组与A组比较,Bcl2蛋白含量增高,差别有统计学意义(q=42.99、52.99,P<0.01); B2组与B1组、B2与假照组之间比较,差别无统计学意义(P>0.05)。随着照射时间延长,Bcl2蛋白的表达呈上升的趋势。见表1。
2.3 凋亡相关蛋白Bax的半定量测定
A组的细胞胞浆中出现较多的黄色颗粒,其次是B1、B2组,染色最淡的是假照组。 各组凋亡相关蛋白Bax的表达水平比较,差别有统计学意义(F=161.45,P<0.01)。其中假照组的Bax蛋白含量最低,A组的最高。各照射组与假照组比较,Bax蛋白含量均增高,差别有高度统计学意义(q=9.34~29.58,P<0.01);B1组、B2组与A组比较,Bax蛋白含量降低,差别有高度统计学意义(q=10.61、20.24,P<0.01);B2组较B1组Bax蛋白含量低,差别有统计学意义 (q=9.63,P<0.05)。见表1。表1 各组小鼠LEWIS肺癌组织细胞的AI、Bcl2及Bax比较(略)
3 讨 论
在传统的放疗中,2 Gy的剂量采用3野照射总的实施时间约6 min,而采用静态调强放疗,完成1次肿瘤量为2 Gy的照射需要20~30 min甚至更长,明显长于常规治疗所需的时间。由于机器的输出量不变,单位时间内组织的吸收剂量降低,按照经典放射生物学理论中的剂量率效应(即当剂量率下降时会增加组织和细胞对射线的抵抗性),这会导致肿瘤控制率下降,使生物效应明显下降[9]。BENEDICT等[10]结果表明,用6 MV的X线照射人恶性胶质瘤细胞,将总的照射剂量分成相等的分割,实施时间16 min~3 h。给予相同的剂量,随着总照射时间的增加,细胞存活率提高。本实验通过测定不同照射时间小鼠LEWIS肺癌组织的凋亡指数,结果与上述报道一致,当照射时间延长时,凋亡指数明显下降,放射效应降低。
Bcl2是典型的凋亡抑制基因,而Bax是促凋亡基因[11]。目前认为Bax表达过量, 自身可形成Bax 同源二聚体,作为线粒体膜上离子通道的组成成分,使细胞色素C 得以穿过线粒体膜,并在细胞质内参与形成凋亡启动复合体,直接启动或诱导细胞凋亡连锁,从而促进细胞凋亡;Bcl2的过度表达可以与Bax竞争结合,形成BaxBcl2异二聚体,封闭Bax 形成孔道的活性,阻止细胞色素C穿过线粒体膜进入细胞质,从而发挥抑制细胞凋亡作用[12,13]。本实验显示,当照射时间从6 min延长至30 min时,Bax表达下降,Bcl2表达增加;当照射时间延长至45 min时,Bax表达更低,Bcl2表达明显增加。上述二者的变化与各组凋亡指数的变化方向一致,即LEWIS肺癌细胞凋亡指数降低时,Bax表达减少,而Bcl2表达增加。照射时间延长诱导LEWIS肺癌细胞凋亡指数下降,可能是通过调节Bax 及Bcl2的表达实现的。
总之,IMRT在物理学上的优势是显而易见的[14],但是延长了相同剂量的照射完成时间,降低了相对剂量率,杀灭细胞的生物效应比常规照射有所下降, 因此,临床实施IMRT时应考虑到照射时间延长、相对剂量率降低这一因素对疗效的影响,可在分次及总剂量上予以适当补偿。
【参考文献】
[1]殷尉伯,田凤华. 2001年全国放射治疗人员及设备调查报告[J]. 中华放射肿瘤学杂志, 2002,11(3):145147.
[2]LAUGIER A. Radiotherapy in France[J]. Radiother Oncol, 1997,43(Suppl 2):34.
[3]KIJEWSKI P K,CHIN L M, BJARNGARD B E. Wedgeshaped dose distributions by computercontrolled collimator motion[J]. Med Phys, 1978,5(3):426429.
[4]刘阳. 三维适形放射治疗中的物理学与生物学[J]. 实用肿瘤学志, 2006,20(4):350352.
[5]FLORIAN S. Radiobiological investigation of doserate effects in intensitymodulated radiation therapy[J]. Strahlentherapyund Onkologie, 2005(1):4248.
[6]FOWLER J F. Loss of biological effect in prolonged fraction delivery[J]. Int J Radia Oncol Biol Phys, 2004,59(1):242249.
[7]GALVIN J M. Implementing IMRT in clinical practice: a joint document of American society for therapeutic radiology and oncology and American association of physicists in medicine[J]. Int J Radia Oncol BiolPhys, 2004,58(5):16161634.
[8]冯林春,王所亭,陈国雄,等. 低氧条件下照射小鼠Lewis肺癌实体瘤的实验研究[J]. 军医进修学院学报, 2000,21(1):2325.
[9]王鑫,何少琴. 精确放疗所面对的生物学问题[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2006,13(10):101104.
[10]BENEDICT S H, LIN P S, ZWICKER R D, et al. The biological effectiveness of intermittent irradiation as a function of overall treatment time: development of correction factors for linacbased stereotactic radiot herapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1997,37(4):765769.
[11]刘伟,于文成,秦筱梅. 非小细胞肺癌Bcl2及Bax蛋白的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(2):149153.
[12]CHENG E H, WEI M C, WEILER S, et al. Bcl2, Bclx (L) sequester BH3 domain only molecules preventing BAX and BAK mediated mitochondrial apoptosis[J]. Mol Cell, 2001,8(3):705711.
[13]刘陶文. 凋亡调控基因BCL2 家族研究的新进展[J]. 生物化学与生物物理进展, 1999,26(3):216219.
[14]王旬果,孙福銮,王建军. 三维适形放射法治疗非小细胞肺癌的效果[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(2):112114.
作者单位:青岛大学医学院附属医院肿瘤治疗研究中心,山东 青岛 266003