小鼠铁过量模型建立及相关指标的观察研究

【摘要】  目的 给小鼠喂以全价颗粒饲料辅以定期定量腹腔注射右旋糖酐铁，快速建立高铁动物模型并观察动物体内铁水平及脏器系数的变化。方法 将雌雄各半的昆明小鼠随机分为4组，以不同浓度的右旋糖酐铁隔日腹腔注射（IP），6周后，观察动物的营养状况并用原子吸收光谱法和全自动生化仪分别测定各脏器中铁的含量和血清中铁的含量，并做各脏器病理组织学检查，计算肝和脾的脏器系数,测定血清中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果 注射铁剂各组小鼠的一般体态发生变化，体质量明显下降。各脏器中铁的含量和血清中铁的含量明显升高，肝脏和脾脏系数也明显升高,且都随剂量的增加而升高(F=115.790～638.621，q=9.301～16 259.490，P<0.01)。病理组织学检查显示组织细胞发生了不同程度的病理损伤、细胞变性。注射铁剂各组血清中MDA的含量较对照组明显升高,SOD的活性则明显下降(F=124.583、102.087，q=5.422～310.240，P<0.01)。结论 给小鼠腹腔注射右旋糖酐铁，可以成功建立高铁动物模型，其各项指标有明显变化并对各脏器造成损害，其机制可能与右旋糖酐铁在体内代谢释放出铁离子，游离的铁离子介导脂质过氧化而造成的损害等有关。

【关键词】  铁右旋糖酐复合物 模型 动物 脂质过氧化作用

　　THE ESTABLISHMENT OF IRONOVERLOAD MOUSE MODEL AND OBSERVATION OF THE RELATED INDEXES
　　LENG HUIMIN, LUO XINMIN, ZHU HANG
　　(Outpatient Department of 72681 Army of PLA, Qingdao 266031, China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo establish an ironoverload animal model by feeding grain feedstuff and intraperitoneal injection of iron dextran. MethodsAn equal number of male and female mice was divided into four groups, intraperitoneal injection of iron dextran of different concentrations was given every other day for six weeks. The animal’s nutrition status was observed, the organs examined histologically, and the iron levels in organs and serum  detected using atomic absorption spectrometry and entire automatic biochemistry meter, the coefficient of liver and spleen calculated, and content of MDA and SOD activity in serum detected.ResultsThe body carriage of the mice changed, their weight decreased. The iron levels in organs and serum increased (P<0.01), liver and spleen coefficient elevated along with the increase of iron dosage.  Histopathologically, pathological damage and cell degeneration could be seen in cells. The serum MDA level was higher and activity of SOD was lower than that of the control group (P<0.01). ConclusionA highiron animal model can be established by intraperitoneal injection of iron dextran. The changes of various parameters result in damage to the organs, it is possible that the ferri ions were released through metabolism of iron dextran and freeion mediates lipid peroxidation to cause the damage.

    ［KEY WORDS］IronDextran complex; Models, animal; Lipid peroxidation

    尽管铁是维持细胞正常生长、代谢的必需微量元素，但是当人体内铁过量时，则会因不能及时排除体外而沉积于肝脏、胰腺、心脏和皮肤，从而引起血色病（血色素沉积所致）、肝功能异常、心肌损伤和糖尿病[1，2]。人们可由于大量食用铁强化食品以及口服、注射铁剂，从而使进入体内的铁含量增加。这已受到许多学者的重视，有关的研究也日益增多。右旋糖酐铁是临床上常用的注射用铁剂，但长期大量使用可引起过敏样反应，高价铁离子是氧化剂，对机体也有害。因此，本实验使用右旋糖酐铁对小鼠进行腹腔注射，建立小鼠高铁模型，在模型建立过程中观察其行为和体态的变化及相关指标的改变，为今后研究高铁对机体的影响提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    全价颗粒饲料购自南方医科大学动物实验中心，含铁量为370 mg/kg。右旋糖酐铁制剂（iron dextran） 由浙江瑞安市制药厂出品，批准文号为国药准字H33021758，规格为每支2 mL，含50 mg元素铁。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。测定所需仪器：XT9900智能微波消解仪、721分光光度计（上海第三分析仪器有限公司）、HITACHI Z8230火焰原子吸收分光光度计（Hitachi,Japan）、低温高速离心机（Bechman,MODEL Allegra TMX22R,USA）、全自动生化仪。

　　1.2  小鼠高铁模型的建立

    昆明小鼠40只（由南方医科大学动物实验中心提供），雌雄各半，体质量18～22 g。随机分为4组：正常组10只，每次腹腔注射（IP）生理盐水0.8 mL；低剂量组10只，每次IP右旋糖酐铁制剂5 mg；中剂量组10只，每次IP右旋糖酐铁制剂10 mg；高剂量组10只，每次IP右旋糖酐铁制剂20 mg。4组小鼠雌雄分养于塑料不锈钢笼内，室内温度为（23±3）℃，自由进食全价颗粒饲料，饮用去离子水。各剂量组隔日IP右旋糖酐铁制剂，共6周。6周末，所有动物全部处死。

　　1.3  测定指标

　　1.3.1  血清铁浓度 

　　摘除小鼠眼球取血，将血液样本置于3 000 r/min、25 ℃的低温高速离心机中离心20 min,分离血清置全自动生化仪进行分析。

　　1.3.2  脏器铁含量

　　处死小鼠，分别取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，用生理盐水漂洗2次，并用滤纸将血液和组织液滤净称质量，取0.15～0.20 g，置于智能微波消解仪中消化后用火焰原子吸收分光光度计测定铁含量。

　　1.3.3  脏器系数 

　　将取出的肝脏和脾脏用电子天平称质量，与体质量比计算出脏器系数值。

　　1.3.4  病理组织学检查 

　　①肉眼观察；②光镜检查：常规切片，苏木精伊红染色，100倍、400倍视野下观察其病理形态学改变；③铁染色分析：常规切片用Tirman法进行铁染色，100倍、400倍视野光镜下观察铁的分布情况。

　　1.3.5  生化指标的测定 

　　①血清SOD活性：采用黄嘌呤氧化酶法测定；②血清MDA含量：采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定。

　　1.4  统计学处理

    所得数据采用SPSS 10.0软件进行统计学处理，结果以±s表示，组间比较采用方差分析。

　　2  结 果

　　2.1  高铁小鼠的一般表现

　　2.1.1  肤色 

　　与正常组比较，高铁各剂量组小鼠在实验第3周开始出现皮毛粗糙、稀疏，毛色失去光泽，耳、脚爪、尾部均出现明显的色泽改变，呈渐深的铁锈色，牙齿呈黄褐色，并随着实验时间的延长和剂量的增加上述表现更加明显。

　　2.1.2  行为改变
 
　　随注射时间的延续，高铁各剂量组小鼠生长缓慢，身体消瘦，表现倦怠，活动减少，反应迟钝，怕冷、嗜睡、蜷缩成团，易受惊吓，饮食明显减少。

　　2.2  体质量

    各组小鼠的体质量变化趋势见图1。随着剂量的逐渐增加，小鼠的体质量呈明显下降趋势。

　　2.3  各脏器铁含量及血清铁浓度

    各剂量组小鼠的脏器铁含量和血清铁浓度均比正常组明显升高，且都随着剂量的增加而升高(F=115.790～638.621，q=43.655～16 259.490，P<0.01)，但心脏中的铁含量在低剂量和中剂量组之间无显著性差异。各主要脏器中肝脏内铁的沉积量最大，心脏内最小，沉积量排列依次为：肝脏>脾脏>肾脏>肺脏>心脏。见表1。表1  各组小鼠脏器铁含量和血清铁浓度测定结果（略）

　　2.4  脏器系数

    各剂量组小鼠肝脏和脾脏系数与正常组比较显著增高，各剂量组之间的脏器系数两两比较差异也均有显著意义(F=278.759、378.642，q=9.301～9.936，P<0.01)。见表2。表2  各组小鼠脏器系数测定结果（略）

　　2.5  血清SOD活性和MDA含量

    各剂量组血清SOD活性明显低于正常组(F=124.583，q=160.291～310.240，P<0.01)，且随给药剂量的增加有降低的趋势；各剂量组血清MDA的含量均明显高于正常组，差异均有显著意义(F=102.087，q=5.422～40.197，P<0.01)。见表3。表3  各组小鼠血清SOD活性和MDA含量比较（略）

　　2.6  病理学检查

    正常组小鼠的肝脏肉眼观察未见明显的病理改变，光镜下细胞排列整齐，细胞形态规则，切片经Schmeltzer法染色后未见被染成蓝色的铁。低剂量组小鼠的肝脏有轻度增大，光镜下可见各脏器的细胞边界不清，排列紊乱，铁染色后可见有点状被染成蓝色的铁，分布均匀。中剂量组小鼠的肝脏可见轻度淤血，肝脏表面散在少量芝麻大小的黄色斑点；光镜下可见各脏器的细胞核消失，铁染色后，被染成蓝色的铁广泛存在。高剂量组小鼠肝脏有明显的淤血现象，整个肝脏呈黑色，脾脏也呈现铁褐色，两者的质量已达到体质量的10%左右；高倍镜下细胞出现坏死，汇管区有多处凝固性坏死灶，出现核固缩、溶解，大量细胞水样变性；铁染色可见普遍存在被染成蓝色的铁。
   
　　3  讨论

    口服铁剂是治疗缺铁性贫血的常用治疗方法，但是当口服无效时或对缺铁病人和怀孕妇女，口服需要较长时间才能建立体内正常的铁储存，因而需要注射铁剂，临床上右旋糖酐铁是常用的注射用铁剂。然而，如果长期注射，会造成体内铁储留，形成慢性铁过载现象，使组织和血清中的铁含量增加，引起器官的广泛受损[3，4]。目前在全世界，铁代谢疾病如血色素沉着症是最普遍的遗传性疾病之一，且此类病人体内组织和血清中铁含量的高低还没有一个有效的措施进行调控，惟一的方法就是进行定期的放血治疗[5，6]。因此，加深对铁毒性致病机制的了解，从而为此类病人提供一个安全有效的治疗措施至关重要。本实验通过喂以全价颗粒饲料(含铁量为370 mg/kg)，辅以定期、定量腹腔注射右旋糖酐铁的方法建立了不同浓度铁对小鼠造成多方面损害的动物模型[7]，并对此模型小鼠的一般体态、各项指标和脂质过氧化反应与正常小鼠进行了比较，从而说明高铁模型建立成功。高铁模型的建立是否成功，对于研究铁代谢疾病起到至关重要的作用。

    在补充铁剂的过程中，小鼠的体态行为变化起初先表现为皮肤苍白，皮毛粗糙、稀疏，生长开始缓慢，并随着实验时间的延长上述症状更加明显，食欲下降，身体消瘦，毛色失去光泽。从第3周开始，耳、脚爪、尾巴均出现明显的色泽改变，呈渐深的铁锈色，牙齿呈黄褐色，行为表现为倦怠，活动减少，反应迟钝，怕冷、嗜睡、蜷缩成团，易受惊吓，饮食明显减少。其表现与铁过量摄入，导致神经和消化功能紊乱有关[8]。本实验结果显示，高铁组体质量比正常组明显下降(P<0.01),脏器系数也与周宏元等[9]报道的小鼠情况近似,体内铁含量与正常组比较差异有显著意义(P<0.01),且随剂量的增加而升高。文献报道，评价是否铁过量，测定血清铁含量是比较灵敏及特异的指标[10]。本实验小鼠的血清铁浓度最低为（64.45±5.04）nmol/L,最高为（116.35±10.13）nmol/L，符合模型的要求。机体的铁主要以铁蛋白的形式存在于肝脏，因此肝脏铁含量显著升高说明体内贮存了大量的铁。许多实验结果表明，铁类物质引起肝损害时肝脏内的铁含量明显升高。HANZLIK等[11]报道，辛基二茂铁被机体吸收后，在肝细胞的细胞色素P450与辅助因子NADPH及分子氧的作用下被羟化，释放出铁离子，这些铁离子贮留在肝脏中使其铁含量升高。RONLD等[12]用辛基二茂铁喂食小鼠，实验结果显示肝脏铁含量明显升高。本次实验用右旋糖酐铁给小鼠隔日腹腔注射6周后，高剂量组小鼠肝脏平均铁含量为正常组的80倍。

    各脏器病理学检查表明，过多的铁可以损伤细胞，使细胞排列紊乱、边界不清，发生变性、坏死等病理改变。铁染色分析结果显示，高铁各剂量组各脏器内含铁物质增多，光镜下可见染成蓝色的铁，且随剂量的增加而分布广泛。由于铁在细胞、组织内沉积，作为一种刺激因子，直接或间接地影响组织细胞代谢，组织内炎症改变十分明显，外观相关脏器组织充血水肿尤以肝组织更为突出，这与文献报道的结果相一致[13]。

    含铁类物质引起的各种损害都与膜脂质过氧化有关。铁为过渡金属元素，有两种价态，铁通过改变价态而释放和接收电子而在许多反应中起着传递电子的作用。铁在脂质过氧化反应中起着非常重要的作用。MDA是一种生物毒性很强的脂质过氧化反应的代表产物，可间接地反映出细胞受损伤的程度[14]。HOGBERG等[15]用体外实验的方法证明，当培养液中铁的浓度升高时，培养液中MDA的含量迅速升高。本实验各剂量组血清中MDA的含量较正常组分别升高了约3、5和7倍。说明右旋糖酐铁释放的铁离子能介导膜脂质过氧化产生大量的脂质过氧化产物。此外，机体内还存在对氧自由基的各级防御体系，其中SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的作用，机体内的自由基会消耗SOD，当机体脂质过氧化水平升高时，SOD的活性会发生改变。本实验各剂量组血清中MDA含量升高时，SOD的活性与正常组相比则明显降低。这与大多数学者关于MDA与SOD在含量和活性上相关联的报道一致，说明由于脂质过氧化作用消耗了大量的SOD，机体对自由基的清除能力下降，造成机体对自由基的防御体系被破坏。

    总之，过量的铁在体内贮存可造成机体广泛的损伤，其作用机制可能与其释放出的铁离子所诱导的膜脂质过氧化反应等有关，确切机制尚有待于进一步研究。

【参考文献】
  　　[1]HANSON E H, IMPERATORE G, BURKE W. HFE gene and hereditary hemochromatosis: a HuGE review. Human genome epidemiology[J]. Am J Epidemiol, 2001,154(3):193206.

　　[2]FEDER J N, GNIRKE A, THMOS W, et al. The discovery of the new haemochromatosis gene[J]. J Hepatol, 2003,38(6):704709.

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　　[4]BARTFAY W J, SHER G D, LEHOTAY D C, et al. Comparison of cytotoxic aldehydes in betathalassemia patients chelated with deferoxamine or deferiprone (L1) versus no chelation[J]. Hematology, 1999,4:6776.

　　[5]FEDER J N, GNIRKE A, THOMAS W. A novel MHC class 1like gene is mutated inpatients with hereditary haemochromatosis[J]. Nature Genetics, 1996,13:399408.

　　[6]LIU P, OLIVIERI N. Ironoverload cardiomyopathies: newinsights into an old disease[J]. Cardiovascular Drugs and Therapy, 1994,8:102106.

　　[7]张传海. 人体铁过多与心脏损害[J]. 临床荟萃, 1995,10(5):193194.

　　[8]BERG D, HOCHSTRASSER H. Iron metabolism in Parkinsonian syndromes[J]. Mov Disord, 2006,[Epub ahead of print].

　　[9]周宏元,毛福英,彭开良,等. 辛基二茂铁对小鼠肝脏毒性作用的实验研究[J]. 海军医学杂志, 2002,23(3):196199.

　　

作者单位：中国人民解放军，山东 青岛 266031