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【摘要】 ［摘要］ 目的 观察枸杞子提取液（LBA）对RCS大鼠遗传性视网膜变性的治疗作用。方法 出生后RCS大鼠24只，随机分为对照组和治疗组，每组12只。治疗组RCS大鼠出生后10 d开始喂食1 mg/kg的LBA, 对照组正常饲养。两组大鼠分别在出生后25、35、45 d取眼球，制备组织切片，应用苏木精2伊红（HE）染色和TUNEL染色观察视网膜感光细胞坏死和凋亡情况，并应用免疫组化方法检测Caspase22的表达。结果 治疗组大鼠出生后25 d和35 d时TUNEL染色阳性细胞与对照组相比明显减少(t=3.33～6.72,P<0.05)；治疗组和对照组大鼠生后25～45 d时Caspase22在节细胞层和内核层均有表达，但在25 d时治疗组与对照组相比明显减少(t=6.33,P<0.05)。结论 在RCS大鼠遗传性视网膜变性的早期，LBA通过抑制细胞凋亡及Caspase22表达对神经元起保护作用。
【关键词】 视网膜变性 细胞凋亡 枸杞子提取液 RCS大鼠
NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF LYCIUM BABARUM ABSTRACT ON HEREDITARY RETINAL DYSTROPHY OF RCS RATS
LIU XIANG²HE, CHI HUAN²FANG
(Department of Anatomy, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China);
［ABSTRACT］ Objective To investigate the neuroprotective effect of the aqueous extract of dried Lycium barbarum (LBA) on hereditary retinal dystrophy of the Royal College of Surgeon (RCS) rats. Methods Twenty²four postnatal RCS rats wereequally randomized to control group (CG) and treatment group (TG). In TG, the rats started a diet of 1 mg/(kg·d) LBA on the day 10 after birth, and in CG, the rats were fed with normal food. Eyeballs were obtained from both groups on day 25, 35 and 45 after birth. Histological sections were prepared with HE or TUNEL staining for observation of photoreceptor cells necrosis and apoptosis. The expression of Caspase²2 protein was detected with immunohistochemistry staining. Results The numbers of cells positively stained with TUNEL in rats of TG 25 and 35 days after birth were significantly decreased compared with those of CG(t=3.33-6.72,P<0.05); The expression of Caspase²2 protein was found in the ganglion cell layer and inner nuclear layer in both groups 25 and 45 days after birth, but the number of Caspase²2 positive cells in TG was significantly smaller than that of CG on day 25 (t=6.33,P<0.05). Conclusion In the early stage of hereditary retinal dystrophy of RCS rats, LBA reveals a neuroprotective effect through inhibiting cell apoptosis and expression of Caspase²2 protein.
［KEY WORDS］ Retinal degeneration; Apoptosis; Lycium barbarum; RCS rats
视网膜色素变性是眼科十分常见的致盲性疾病，世界范围内发病率为1/3 000～1/4 500，目前在我国其发病率呈逐年上升趋势。RCS大鼠为自发性蜕变的鼠种，自从1938年BOURNE等[1]首次报道以来，已经成为研究视网膜色素变性的经典动物模型，其主要表现为视网膜色素上皮（RPE）不能有效吞噬感光细胞外节脱落的膜盘，致使膜盘堆积，感光细胞变性。枸杞子是茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L．)的成熟干燥果实，为我国常用中药。已有研究显示，枸杞子对青光眼的节细胞（RGCs）有神经保护作用，可以显著减少RGCs 的凋亡作用，而这种神经保护作用是在眼内高压没有降低的情况下发生的[2]。本实验给RCS大鼠喂食枸杞子提取液（LBA）, 从感光细胞开始凋亡时观察LBA对神经元的保护作用，为临床上日益增多的视网膜色素变性疾病的治疗提供实验和理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物分组及处理
出生后24 h雄性RCS大鼠24只，随机分为对照组和治疗组，每组12只。12 h光照、12 h黑暗循环条件下饲养，自由饮食、饮水。治疗组RCS大鼠在出生后10 d开始每天喂食1 mg/kg的LBA（香港大学馈赠）,对照组RCS大鼠正常饲养。两组大鼠分别在生后25、35、45 d用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉，取出眼球，每次每组随机取4只大鼠。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 标本制作 眼球取出冲洗后立即放入40 g/L多聚甲醛中固定6 h，去眼前节及玻璃体，依次放入100 g/L蔗糖2 h、200 g/L蔗糖2 h、300 g/L蔗糖过夜。用OCT包埋剂填充眼球,沿眼球矢状面作连续冷冻切片，厚度5 μｍ。
1.2.2 组织形态观察 采用苏木精²伊红染色方法，按常规方法操作。应用OLYMPUS BX50获得显微图像，进行组织学观察。
1.2.3 细胞凋亡检测 采用TUNEL染色方法，阴性对照切片不加末端核糖核酸转移酶,阳性对照切片在反应前先用DNA酶Ⅰ消化。TUNEL阳性表达为细胞核呈绿色荧光，定位于视网膜外核层。采用OLYMPUS BX50获得显微图像。应用美国Sample PCI图像分析系统测定吸光度（A）值，每张切片测定5个视野取其平均值，作为切片的测定值。
1.2.4 Caspase²2表达检测 采用免疫组化的方法检测,阴性对照切片不加一抗。应用OLYMPUS BX50获得显微图像。应用美国Sample PCI图像分析系统进行平均吸光度测定，每张切片测定5个视野取其平均值，作为切片的测定值。
1.3 统计学处理
采用SPSS 10.0和PPMS 1.5[3]统计软件进行数据处理，两样本均数比较采用t检验。
2 结果
2.1 组织形态学观察
对照组大鼠出生后25 d时，视网膜各层结构整齐，细胞形态规则;35 d时，外核层变薄，细胞密度降低;45 d时，外核层进一步变薄，细胞密度降低，细胞形态不规则，但内核层及节细胞层改变不明显。与对照组比较，治疗组大鼠25 d及35 d时，视网膜外核层明显增厚，细胞密度增加。
2.2 细胞凋亡检测
对照组RCS大鼠出生后25 d时，视网膜外核层可观察到少许TUNEL染色阳性细胞；35 d时，TUNEL染色阳性细胞增加；45 d时，阳性细胞减少。治疗组RCS大鼠出生后25、35 d时，外核层也可以观察到TUNEL阳性表达细胞，与对照组相比，差异有统计学意义（t=3.33、6.72，P<0.05）。见表1。
2.3 Caspase²2表达
对照组和治疗组RCS大鼠出生后35～45 d，在节细胞层和内核层均观察到Caspase²2阳性染色。治疗组RCS大鼠在25 d时Caspase²2阳性表达低于对照组（t=6.33,P<0.05）。见表2。
3 讨论
表1 两组TUNEL阳性表达比较（略）
与对照组比较,#t=3.33,P<0.05;*t=6.72,P<0.05
表2 两组Caspase²2阳性表达比较（略）
与对照组比较，*t=6.33,P<0.05
自1857年DANDERS首次报道视网膜色素变性以来，众多学者对此进行了广泛的研究。但该病一直没有有效的治疗方法。目前对视网膜色素变性的治疗方法主要有： 基因治疗、感光细胞移植、药物干预。前两种方法因存在目前尚难解决的一些技术问题使其应用受到很大限制，而药物干预则显示了良好的应用前景。
目前，有很多研究的焦点集中到了枸杞子对眼睛的治疗作用。香港大学2006年的研究显示，LBA对青光眼的RGCs有神经保护作用，首次在体内实验中证明枸杞子可以显著减少眼内高压模型大鼠RGCs 的凋亡[4]。在本实验中， 苏木精²伊红染色观察显示，治疗组RCS大鼠在出生后25、35 d时外核层的厚度及细胞密度大于对照组。TUNEL染色结果显示,治疗组RCS大鼠在出生后25、35 d时的细胞凋亡较对照组明显减少，这一结果提示LBA在RCS大鼠感光细胞变性的早期对感光细胞可能有保护作用。本实验结果还显示，45 d时治疗组与对照组视网膜外核层的厚度和细胞的密度无明显差异，这与TUNEL染色结果相似，其原因可能是由于RCS大鼠出生后25 d感光细胞发生凋亡，35 d是感光细胞凋亡的高峰期,随着感光细胞的凋亡，外核层细胞数目减少。
Caspase 即半胱氨酸天冬氨酸酶,通常以无活性的蛋白酶原形式在细胞内合成和分泌[4]。在放射线、氧化损伤、缺血、低氧等诱导凋亡信号的刺激下,酶原形成四聚体而活化,形成 Caspase 活化级联反应。Caspase 一经激活裂解其作用底物,细胞凋亡便不可逆地进入实施阶段,并以细胞解体、凋亡小体形成而告终。本实验中，治疗组和对照组RCS大鼠生后25～45 d在视网膜节细胞层和内核层均观察到Caspase²2阳性染色,治疗组大鼠出生后25 d内核层 Caspase²2阳性表达的平均吸光度小于对照组；两组大鼠内核层Caspase²2阳性表达在35 d达到高峰,其趋势与 TUNEL染色结果相一致。提示LBA在RCS大鼠感光细胞变性的早期对感光细胞有保护作用，其机制可能与抑制 Caspase²2蛋白的表达有关。
【参考文献】
[1]BOURNE M C, CAMPELL D A, TANSLEY K. Hereditary degeneration of the rat retina[J]. Br J Ophthalmol, 1938,22:6132623.
[2]HIU2CHI C, RAYMOND C. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma[J]. Experimental Neurology, 2007,20:2692273.
[3]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):91293.
[4]陶涛,迟焕芳,曹文强. 金纳多对 RCS 鼠视网膜色素变性神经元保护作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(2):1562158.
作者单位：青岛大学医学院人体解剖学教研室,山东 青岛 266021