免疫损伤-高脂喂养法建立兔动脉粥样硬化模型评价

【摘要】  目的 探讨建立兔动脉粥样硬化模型的方法。方法 成年健康新西兰兔10只，随机分为两组，对照组兔常规饲养；模型组兔应用小牛血清清蛋白免疫损伤，高脂饮食喂养，两组均饲养8周。经耳缘静脉取血检测胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及血浆溶血磷脂酸水平；取颈内动脉，应用苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化法测定细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 （Emmprin）和金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）表达。结果模型组造模后，血浆溶血磷脂酸水平明显升高，差异有统计学意义(t=11.265,P<0.05)；模型组颈内动脉未形成明显的动脉粥样硬化斑块，Emmprin和TIMP-1未见明显表达。结论 免疫损伤-高脂喂养法不易于短期内建立兔动脉粥样硬化模型。

【关键词】  动脉硬化 模型 动物 兔

动脉粥样硬化是缺血性脑血管病的重要危险因素，姜丹等［１］研究显示，脑梗死病人约82.35%存在不同程度的颈动脉粥样硬化。动脉粥样硬化早期内皮细胞激活，其半透膜功能丧失，使脂类物质、炎性细胞浸润，最终转化成泡沫细胞，内皮细胞增殖和泡沫细胞的浸润形成了动脉粥样硬化斑块［2］。兔是食草动物，很难自发形成动脉粥样硬化，但是对高脂饲料敏感，是制作动脉粥样硬化模型的候选动物。本实验旨在探讨免疫损伤-高脂喂养法建立兔动脉粥样硬化模型的可行性。

    1  材料和方法

    1.1  动物分组及模型的建立

    成年健康雄性新西兰兔10只，体质量2.2～3.0 kg，平均（2.50±0.25）kg，SPF级，由山东省农业科学院实验动物中心提供，随机分为对照组和模型组，每组5只。各组分笼喂养，室温控制在（23±2）℃，湿度40%～60%，自然光照，自足饮水，喂养条件相同。常规饮食饲养1周后，模型组一次性经耳缘静脉注射小牛血清白蛋白250 mg/kg，然后行高脂饮食饲养；对照组一次性经耳缘静脉注射等量生理盐水后常规饲料喂养，两组继续喂养8周。高脂饲料配方：940 g/kg普通饲料＋50 g/kg猪油＋10 g/kg蛋黄。

    1.2  血液指标检测及方法

    两组动物分别于实验开始和饲养8周后，耳缘静脉采血约8 mL，分别检测胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及血浆溶血磷脂酸（LPA）。LPA检测采用与其极性相似总磷脂分析试剂盒（北京泰福仕科技开发有限公司），严格按照说明书要求进行操作。

    1.3  颈内动脉的形态观察    两组动物饲养8周耳缘静脉采血后，水合氯醛麻醉，取颈内动脉，生理盐水冲洗后40 g/L多聚甲醛溶液固定，4 ℃保存备用。组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度7 μm，部分切片行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察颈内动脉的形态。

    1.4  细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Emmprin）和金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）表达检测

    采用免疫组化染色方法检测颈动脉Emmprin和TIMP-1表达。Emmprin抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，TIMP-1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。严格按照试剂盒说明书操作，DAB显色后，光镜下观察，细胞浆或细胞核出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。以0.1 mol/L的PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.5  统计学方法

    应用SPSS 13.0 及PPMS 1.5［3］统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，两均数间比较采用t检验。P<0.05为有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  两组造模前后血脂及LPA水平比较

    对照组造模前后比较，三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和血浆LPA水平差异均无统计学意义（P>0.05）。模型组造模前后比较，血浆LPA水平差异有显著性（t=11.265，P<0.05），而三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白与低密度脂蛋白差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。 表1  两组造模前后血脂及LPA水平比较

    2.2  组织学观察

    HE染色显示，对照组与模型组动脉管腔均呈圆形，内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由单层内皮细胞覆盖，细胞完整、排列整齐；中膜主要见梭形平滑肌细胞；外膜较薄，为疏松结缔组织。对照组与模型组动脉均未见泡沫细胞堆积及动脉粥样硬化斑块形成。

    2.3  免疫组化染色

    对照组与模型组颈内动脉内膜呈棕黄色非特异性染色。动脉内膜内皮细胞和中层平滑肌细胞均未见Emmprin和TIMP-1特异性棕黄色表达颗粒。

    3  讨    论

    MMP可以削弱血管内皮细胞屏障功能，促进中层血管平滑肌细胞迁移和增殖，加重血管的结构改变，进一步促进循环炎性细胞浸润，斑块破裂，从而促进动脉粥样硬化的发生、发展［4］。TIMP-1 是MMP的天然抑制物，与MMP及其酶原结合形成复合物以调节MMP激活过程。Emmprin 存在于人、鼠和兔动脉粥样硬化斑块，通过调节斑块局部MMP的分泌和活性，进而影响动脉粥样硬化斑块的稳定性［5］。以上三者均可作为动脉粥样硬化斑块形成的参考指标。

    成功建立动脉粥样硬化模型是研究动脉粥样硬化发病机制及探讨其治疗措施的基础。目前，可以制作动脉粥样硬化模型的动物主要有：兔、大鼠、基因工程小鼠、猪和猴等。其中猪和猴为哺乳动物，其解剖结构、饮食结构等与人较接近，高脂饮食条件下能够产生动脉粥样硬化，是研究人类动脉粥样硬化的理想模型。但是由于这两种动物购买及饲养成本昂贵、饲养难度大、制作模型的周期长且所检测指标的试剂较难获得，限制了其作为模型动物的大规模应用。基因工程小鼠较易形成动脉粥样硬化，近年来受到广泛关注，但其价格昂贵，体质差，死亡率高，因此也限制了其使用。大鼠和兔是目前研究动脉粥样硬化最常用的模型动物，大鼠虽具有抗动脉粥样硬化性，但是作为实验动物，具有价格低廉、较易获得、易于饲养、生存能力强等特点，应用较广泛。兔属草食性动物，不易自发性产生动脉粥样硬化，但其对高脂饮食较敏感，价格低廉，易获得，制作模型所需周期短。

    MENG等［6］研究显示,以兔为模型动物，采用球囊损伤＋高脂饮食法可在8周内形成典型动脉粥样硬化斑块。CHIESA等［7］以兔为实验对象，采用干燥气体损伤结合高脂饲料喂养，亦可在短期内成功制作双侧颈动脉粥样硬化模型。这些方法虽较可靠且造模周期短，但其费用较高、操作复杂、对动物损伤较大，而限制了其广泛应用。颜彦等［8］报道，以79.5%普通饲料＋0.5%胆固醇＋0.5%猪油＋15.0%蛋黄为配方的高脂饮食饲养，可使兔于8周后形成动脉粥样硬化模型。田建会等［9］采用1%胆固醇+5%猪油+94%普通饲料为高脂饲料配方，饲养兔10周后可形成动脉粥样硬化模型。王园园等［10］在高脂饲料中添加1%维生素D，并连续9 d每日加喂1 g胆固醇和1 g维生素D，可使兔于8周内形成动脉粥样硬化模型。由于维生素D可导致血钙升高，促使钙盐在主动脉中膜沉积，使平滑肌细胞变性或钙化，同时高钙血症可以协同高脂血症破坏动脉管壁内皮的完整性，从而有利于血浆脂质对管壁的侵入、损伤和沉积，故高脂饲料＋维生素D可更有效建立兔动脉粥样硬化模型，且其斑块性质与人更为相似［11］。齐鲁医学杂志2009年6月第24卷第3期  Med J Qilu, June 2009, Vol.24, No.30

    本研究采用高脂饲料配方，饲养兔8周后，血浆LPA水平升高，与对照组比较差异有统计学意义。LPA在动脉粥样硬化早期阶段可诱导屏障功能障碍，促进内皮细胞与单核细胞的黏附，引起血管中层分化，促进新内膜形成；同时可刺激成纤维细胞增生，促炎症细胞存活，可能在动脉粥样硬化进展期的血管损伤中起核心作用［12］。本实验未添加胆固醇，且蛋黄比例明显较低，因兔未进食足量胆固醇，8周后血液中胆固醇含量仅为（1.83±0.28） mmol/L，未形成高胆固醇血症，最终未形成明显的动脉粥样硬化斑块。因此，高脂饲料中胆固醇含量充足，并加入维生素D以促进动脉粥样硬化斑块的形成和成熟，同时适当延长喂养时间以提高造模的成功率。

【参考文献】
  ［１］姜丹,定正超,尚炯炯,等. 脑梗死与颈动脉粥样硬化的相关性［J］. 中国康复, 2003,18(3):142-143.

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［3］周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS统计软件的功能及其应用［J］. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):91-93.

［4］LAMBERT E, DASSE E, HAYE B, et al. TIMPs as multifacial proteins［J］. Crit Rev Onco Hem, 2004,49(3):187-198.

［5］YOON Y W, KWON H M, HWANG K C, et al. Up stream regulation of matrixmetalloproteinase by Emmprin, extracellularmatrixmetallop roteinase inducer in advanced atherosclerotic plaque［J］. Atherosclerosis, 2005,180(1) 37-44.

［6］MENG L, LV B, ZHANG S, et al. In vivo optical coherence tomography of experimental thrombosis in a rabbit carotid model［J］. Heart, 2008,94(6):777-780.

［7］CHIESA G, RINGAMONTIN E, MONTEGGIA E, et al.Evaluation of a soft atherosclerotic lesion in the rabbit aorta by an invasive IVUS method versus a non-invasive MRI technology［J］. Atherosclerosis, 2004,174(1):25-33.

［8］颜彦,王翔飞,张庆勇,等. 罗格列酮对兔动脉粥样硬化的预防作用［J］. 复旦学报(医学版), 2005,32(5):601-603.

［9］田建会,丁思华,戚萍,等.卡维地洛抗动脉粥样硬化作用的研究［J］. 青岛大学医学院学报, 2007,43(1):36-39.

［10］王园园,龙民慧,周磊磊,等. 兔动脉粥样硬化动物模型的建立和评价［J］. 实验动物科学, 2008,25(3):18-21.

［11］刘磊,焦向英,张炜芳,等. 高脂饲料及维生素D3联合应用建立大鼠动脉粥样硬化模型［J］. 山西医科大学学报, 2005,36(6):681-683.

［12］PANETTI T S. Differential effects of sphingosine 1-phosphate and lysophosphatidic acid on endothelial cells［J］. Biochim Biophys Acta, 2002,1582(1-3):190-196.

作者单位：青岛大学医学院附属医院神经内科,山东 青岛 266003