点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨人着色性干皮病G组（XPG）C46T基因多态性与以奥沙利铂为主的晚期结直肠癌化疗敏感性的关系。方法 经病理检查确诊的Ⅳ期结直肠癌病人73例，治疗前提取外周血DNA，应用TaqMan-MGB探针等位基因分型技术进行基因分型，比较其基因型与接受奥沙利铂化疗病人的2周期临床疗效、无进展生存期（PFS）的关系。结果 C/C野生基因型病人的近期有效率（73.0％）明显高于C/T+T/T突变基因型的病人(P=0.014)；C/C基因型病人PFS（中位时间为11个月）明显长于C/T+T/T基因型病人（6个月），差异具有显著性(χ2=28.90，P<0.01)。结论 XPGC46T基因多态性可能与以奥沙利铂化疗的晚期结直肠癌病人化疗敏感性和生存时间相关。
【关键词】 结直肠肿瘤 DNA修复基因 XPG 单核苷酸多态性 奥沙利铂
结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率近年来有上升趋势［１］，约有一半的病人发生转移或复发。全身化疗一直是转移性结直肠癌的标准治疗方案。20世纪90年代后期奥沙利铂的问世使晚期结直肠癌治疗的近期有效率及生存期均得到了显著提高，但疗效仍存在较大的个体差异，其中遗传因素的影响占到20％～95％［2］。而单核苷酸多态性（SNPs)是人类遗传变异中最常见的一种，通过检测SNPs的遗传多态性标记可揭示不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因，从而为针对性用药和药物开发提供指导和依据。奥沙利铂主要通过与细胞内DNA 结合，形成铂-DNA加合物，引起DNA损伤，从而导致细胞死亡。因此,个体DNA 修复能力是影响药物疗效的重要因素,其中核苷酸切除修复系统(NER)是机体修复化疗药物所致DNA损伤尤其是铂-DNA 加合物损伤的主要机制。人着色性干皮病G组（XPG）在NER中负责切除损伤DNA的3′端，其存在多个SNPs，其中第46位点C→T的突变为无义突变（都编码精氨酸），但却可以影响XPG蛋白的修复能力而影响奥沙利铂的疗效［3］。本研究旨在探讨XPG基因C46T位点的SNPs与中国汉族人晚期结直肠癌奥沙利铂化疗敏感性的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集本院2005年9月～2007年12月收治的经病理检查确诊的晚期结直肠癌病人73例(均为Ⅳ期), 其中男40例，女33例；年龄24～80岁（≤50岁13例，51～69岁45例，≥70岁15例），中位年龄55岁；结肠癌31例，直肠癌42例；转移累及一个器官39例，＞1个器官34例；初治时体力状态(PS)评分（ECOG/WHO）≤1者53例，PS评分2者20例。所有病人经CT或MRI扫描均证实至少有一个可测量的肿瘤病灶,预计生存期至少3个月，血常规、肝肾功能、心电图检查均正常。所有病人均知情并签署知情同意书。
1.2 治疗方案
病人均采用改良FOL FOX4 方案化疗,奥沙利铂130 mg/m2,第1天；亚叶酸钙130 mg/m2, 第1～5天；氟尿嘧啶300 mg/m2，静滴4 h，第1～5天,每3周重复。病人将接受治疗直到出现肿瘤进展或死亡，或不能耐受治疗毒性反应为止。2周期后按照RECIST评价标准评价疗效, 有效者继用原方案化疗，无效者改用其他方案, KPS 评分<60分时给予对症支持治疗。
1.3 疗效评价标准及观察指标
对有可测量病灶者采用RECIST统一标准进行疗效评价，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。主要观察指标：2周期临床获益率（CR+PR+SD）及无进展生存期（PFS）。所有病人随访至2008年6月30日，到随访结束时有2例病人未统计出疾病进展时间，定为截尾值。
1.4 基因检测
化疗前抽取病人静脉血2 mL，枸橼酸钠抗凝，现场登记姓名和编号，当天送本肿瘤治疗研究中心置-20 ℃冰箱保存。统一应用血液基因组DNA快速抽提纯化试剂盒(上海，华舜)提取基因组DNA,提取的DNA在紫外线分光光度仪上进行质量测定，A值1.6～2.0。引物和探针购自美国AB公司（Lot Number 1047768 Assay ID c-1891769-20）。PCR反应体系为25 μL：含Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)12.5 μL，20×Taqman SNP Genotyping Assay Mix 1.25 μL, 10 mg/L的基因组DNA2 μL,超纯水9.25 μL。在ROTOR-GENE RG-3000荧光定量PCR仪上扩增反应：95 ℃ 10 min进行AmpliTaq 金牌酶的活化，92 ℃ 15 s进行变性，60 ℃1 min进行退火及延伸，共40个循环，仪器自动收集荧光信号，SDS软件分析给出SNP分型结果。为保证基因分型的准确性，随机挑选20例标本由另一操作者进行重复实验，结果与第一次完全一致。
1.5 统计学分析
基因分布情况经Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验。基因多态性与73例Ⅳ期病人化疗后的临床获益率之间的关系用卡方检验及 Fisher精确检验，并经Logistic 回归模型计算OR及95％CI。用Kaplan-meier法计算中位PFS, 以Log-rank test比较不同基因型与PFS之间的关系，用Cox比例风险模型评估各可能的影响因素对PFS的影响,并计算OR及95％CI。所有检验的P值均为双尾，以P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。
2 结 果
2.1 XPG基因型分布及遗传平衡检验
本研究中73例Ⅳ期结直肠癌病人XPG基因46位密码子存在3种等位基因型，其频率分别为：C/C型50.68%(37/73), C/T型39.72%(29/73),T/T 型9.60%(7/73)。经χ2检验差异无显著性（χ2=0.061，P>0.05），符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，因此该人群具有代表性。
2.2 XPG基因多态性与临床获益率的关系
73例Ⅳ期结直肠癌病人治疗2周期后评价疗效，其中CR者0例，PR者23例，SD者20例，PD者30例，临床获益率为63.01%。由于XPG46 T/T基因型例数过少，将其与C/T基因型合并。并按治疗效果将病人分为临床获益组（CR+PR+SD）和非获益组（即不敏感组）。XPG基因C46T基因型C/C与C/T+T/T在化疗获益组中分别为27例（73.0％）、16例（44.4%），而在非获益组中则分别为10例（27.0％）、20例（55.6%），两组间分布频率差异有显著意义（χ2=6.135，P<0.05）。经Logistic回归统计校正此组病人的性别、年龄、部位、转移灶数目、PS评分等因素后，XPG基因型仍与化疗敏感性明显相关（P=0.014），其OR值为3.375,提示XPG基因第46位密码子携带C/C基因型的个体化疗敏感性是C/T+T/T基因型的3.375倍,其95% CI为1.268～8.984。
2.3 XPG基因多态性与中位PFS的关系
73例晚期结直肠癌病人中位PFS为8个月(含2例截尾数据)，C/C基因型中位PFS为11个月（95％ CI为9.75～12.25），C/T+T/T基因型为6个月(95％ CI为5.16～6.70），两者比较差异有极显著性（χ2=28.90，P<0.01）。Cox 比例风险模型用于分析性别、年龄、PS评分等多种可能的影响因素与PFS的关系，结果显示，校正这些因素后仅XPG基因型与PFS呈显著相关性(OR=3.787，95% CI为1.968～7.286，P<0.01)，提示该位点SNP可以作为奥沙利铂治疗结直肠癌病人PFS的预测指标。见图1。
图1 XPG46C/T多态性与PFS关系曲线图
3 讨 论
NER是清除铂类化合物所致DNA螺旋扭曲的惟一机制，其修复过程分为5个步骤，涉及30多种多肽。①识别DNA的损伤部位，主要是XPC-hHR23B复合体与XPE参与。②XPA-RPA复合体招募基础转录因子TFIIH到达损伤部位，TFIIH的两个亚基XPB 与XPD 具有解旋酶活性，它们与XPA-RPA共同打开加合物周围的DNA，并允许结构特异的核酸酶剪切DNA［4］。③在损伤部位的两端引入切割酶切下损伤的核苷酸片段：由ERCC1／XPF复合物切开受损DNA链的5′端，由 XPG切开受损DNA链的3′端，从而切除受损的片段。④在DNA聚合酶的催化下，填补已切除的空隙［5］。⑤由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。在NER其中，XPG发挥核酸内切酶的作用。XPG又称ERCC5，其定位于人类染色体13q33，大小为30 kb，包含15个外显子和14个内含子，编码含1 186个氨基酸的蛋白质。它属于Fen-1家族的结构特异性核酸酶，其功能是从3′端切除损伤DNA，还可以在XPF/ERCC1的5′端切除中起非酶性作用。已有研究者在非小细胞肺癌（NSCLC）、喉癌、结直肠癌等多种肿瘤的研究中发现XPG基因多态性与这些肿瘤的关系,这些结果均提示XPG多态性可能影响DNA修复能力〖6～9〗。
XPG 46C-T突变为无义突变，但是却可以影响XPG蛋白的修复能力。VILA 等［3］分析发现，XPG第46位C/C基因型病人的客观缓解率显著高于C／T和T／T基因型的病人(P=0.002)。MONZO等［9］报道，接受奥沙利铂治疗的晚期结直肠癌病人，XPG C/C基因型的疾病进展时间及中位生存期明显高于具有C/T和T/T基因型的病人（P=0.009、0.001）。提示该位点的SNP可以作为奥沙利铂治疗结直肠癌病人客观缓解率、疾病进展时间以及生存期的预测指标。
在本研究中，以73例中国汉族Ⅳ期结直肠癌病人为研究对象，从基因起源上，C/C基因型为野生型，C/T和T/T基因型为突变型,T/T基因型例数少，因此处理数据时将C/T及T/T基因型按非野生型作为一组处理。本研究结果显示，C/C基因型的近期有效率明显高于突变基因型（P<0.05）,提示XPGC46T SNP与奥沙利铂的近期效应有关并具有统计学意义。经过校正病人的性别、年龄、病变部位、转移灶数目、PS评分等因素后，仍显示基因型与化疗敏感性之间是相关的，提示XPG携带46C/C基因型的个体化疗敏感性是C/T+T/T基因型的3.375倍。在疾病进展时间上, C/C基因型病人长于C/T+T/T基因型病人，中位时间分别为11个月和6个月，两条曲线有明显分离的趋势，即该点SNP与奥沙利铂化疗后的远期效应有关。在Cox分析中，校正病人性别、年龄、转移灶数目、病变部位、PS评分等因素后，发现XPGC46T基因型与PFS呈明显相关（P<0.01）。本研究结果提示,DNA修复基因XPG SNP有可能作为检测指标预测铂类药物的化疗效果。化疗的敏感性与病理类型及分化程度有着显著的关系，而本研究的病理类型却是多样化的，要获得能反映真实情况的结果，可能还需继续深入研究生存期等指标，并需更大的样本含量、精确的疾病分型、多基因联合分析和多因素分析，更进一步深入研究，从而指导个体化治疗。
【参考文献】
［１］张静,赵海青. 结肠癌PTEN基因点突变的PCR2SSCP检测［J］. 齐鲁医学杂志, 2004,19(6):474-476.
［2］FUJITA K, SASAKI Y. Pharmacogenomics in drug-metabolizing enzymes catalyzing anticancer drugs for personalized cancer chemotherapy ［J］. Curr Drug Metab, 2007,8(6):554-562.
［3］VILA J M, MORENO I, MONZO M, et al. XPD,XPA,ERCC1 and XPG／ERCC5 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in oxaliplatin-treated colorectal cancer (CRC)［J］. J Clin Oncol, 2004,22:3677.
［4］ARAUJO S J, NIGG E A, WOOD R D. Strong functional interactions of the TFIIH with XPC and XPG in human DNA nucleotide excision repair without a preassembled repairosome［J］. Mol Cell Biol, 2001,21:2281-2291.
［5］VAN STEEG H, KRAEMER K H. Xeroderma pigmentosum and the role of UV induced DNA damage in skin cancer［J］. Mol Med Today, 1999,5:86-94.
［6］于庆忠,韩金祥,潘继红,等. NSCLC患者XPG、MDR 21基因单核苷酸多态性与铂类药物化疗疗效的关系［J］. 山东医药, 2007,47(9)：7-9.
［7］JEON H S, KIM K M, PARK S H, et al. Relationship between XPG codon 1104 polymorphism and risk of primary lung cancer［J］. Carcinogenesis, 2003, 24(10):1677-1681.
［8］温树信,唐平章,张雪梅,等. 着色性干皮病G组基因多态性与喉癌和喉咽癌风险的相关性［J］. 中国医学科学院学报, 2006, 28 (5):703-706.
［9］MONZO M, MORENO I, NAVARROO A, et al. Single nucleotide polymorphisms in nucleotide excision repair genes XPA, XPD, XPG and ERCC1 in advanced colorectal cancer patients treated with first-line oxaliplatin/fluoropyrimidine［J］. Oncology, 2007,72(5-6):364-370.
作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤治疗研究中心，山东 青岛 266003