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【摘要】 目的 检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）在口腔鳞状细胞癌（鳞癌）和癌旁组织中的表达情况，探讨VEGF-C在口腔鳞癌的增殖、浸润和淋巴转移中的作用。方法 采用免疫组化方法检测60例口腔鳞癌病人癌组织和癌旁组织中VEGF-C的表达，应用图像分析系统进行分析，用Spearman相关分析研究其与病变部位、肿瘤大小、病理分级、临床分期及颈淋巴结转移之间的关系。结果 口腔鳞癌组织VEGF-C的表达明显高于癌旁组织 (u=7.747,P<0.01)，其表达强度与临床分期及淋巴结转移密切相关（r=0.564、0.706,P<0.05），与病变部位、大小、病理分级无关。结论 口腔鳞癌细胞分泌VEGF-C诱导癌周淋巴管增生扩张是发生区域淋巴结转移的重要因素之一，VEGF-C有望作为早期临床判断和预测颈淋巴结转移的指标之一。
【关键词】 血管内皮生长因子-C 口腔 肿瘤 鳞状细胞 免疫组织化学
血管内皮生长因子-C(VEGF-C)属于VEGF家族成员，其主要功能为增强淋巴管内皮细胞的趋化性、促进细胞增殖和淋巴管的增加，因此又被称为淋巴管生长因子。研究表明,VEGF-C是口腔鳞状细胞癌（鳞癌）的差异表达基因，其在口腔鳞癌中表达升高，但其临床意义尚需要进一步研究。本文采用免疫组化方法检测其在口腔鳞癌中的表达，探讨其临床意义。
1 资料和方法
1.1 病例选择
2005年1月～2008年5月，选取在青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科手术治疗的口腔鳞癌病人60例,取其癌周正常组织和鳞癌组织。60例病人中男34例, 女26例; 年龄29～85岁, 中位年龄62岁。其中舌癌24例, 其他部位共36例，包括颊癌7例、牙龈癌13例、口底癌6例、腭癌3例、唇癌7例。病理分级: Ⅰ 级37例, Ⅱ级16例，Ⅲ 级7例。临床分期:Ⅰ～Ⅱ期30例, Ⅲ～Ⅳ期30例。颈淋巴结有转移者20例,无转移者40例。所有原发灶及颈淋巴结转移灶均经病理证实。
病例纳入标准:①术前未接受放、化疗及任何生物治疗;②癌旁组织位于肿瘤边缘外2.0 cm以上, 经病理证实无癌变。排除标准: 非原发于口腔的转移癌(多原发癌除外)。
1.2 主要试剂和仪器
兔抗人多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；PV 6000二步法免疫组织化学检测试剂盒（Zymed公司，美国）；Sample PCI图像分析系统（Compix公司，美国）。
1.3 免疫组织化学染色
所有的病理标本均常规经40 g/L中性甲醛溶液固定, 逐级乙醇脱水, 石蜡包埋，3 μm厚切片，采用免疫组化通用型两步法染色,各步骤严格控制时间和温度,每次染色设置阳性及阴性对照，DAB显色，镜下控制显色时间。脱水，透明，封片,显微镜下观察，阳性表达为细胞胞浆呈棕黄色颗粒状。
1.4 图像定量分析
免疫组化染色结果利用美国Sample PCI图像分析系统进行测定，将免疫组化染色结果转化为平均吸光度值（A值）进行定量分析，每张切片测定5个视野取其平均值，作为切片的测定值。切片阳性表达的强弱与A值呈正相关。
1.5 统计学分析
采用SPSS 10.0统计软件包对结果进行分析。口腔癌旁组织与口腔鳞癌组织比较（方差不齐），采用Wilcoxon方法进行检验；口腔癌旁正常黏膜、高分化鳞癌、中低分化鳞癌组织比较（方差不齐）采用Mann-Whitney U方法进行检验; VEGF-C与临床病理因素的关系采用Spearman相关分析。
2 结 果
2.1 VEGF-C在口腔鳞癌和癌旁组织中的表达
VEGF-C 表达阳性呈棕黄色颗粒状,位于胞浆内。在癌旁组织中,阳性反应较弱,主要位于上皮基底层。鳞癌组织中肿瘤细胞阳性反应程度增加,呈弥散性、局灶性或散在性分布。癌旁组织VEGF-C的A值为0.084 2±0.001 8，口腔鳞癌组织为0.131 5±0.005 2，其中高分化鳞癌为0.126 7±0.006 9，中低分化鳞癌为0.138 9±0.007 8。口腔鳞癌组织中VEGF-C的表达高于癌旁组织(u=7.747,P<0.01); 高分化与中低分化口腔鳞癌组织VEGF-C表达均高于癌旁组织(u=6.335、6.339,P<0.01)。
2.2 口腔鳞癌组织中VEGF-C表达与临床病理指标的关系
VEGF-C阳性表达与临床分期、淋巴结转移呈正相关（r=0.564、0.706,P<0.01），而与肿瘤大小、病变部位、病理分级无明显相关。见表1。
3 讨 论
VEGF-C作为迄今为止发现的惟一的淋巴管内皮细胞刺激因子［１］，能与淋巴内皮细胞上特异性分布的flt-4（VEGFR-3）受体结合而发挥作用，在体内与体外都有促淋巴管生成作用。近年来研究证实，VEGF-C在结肠癌、乳癌、前列腺癌、肺癌等癌组织中呈高表达，且其高表达与癌周组织的淋巴管增加、表1 口腔鳞癌组织VEGF-C表达与临床病理指标的关系注：*P<0.01
淋巴结转移均呈正相关〖2～5〗。陈万涛［6］对40余篇2000～2005年间有关头颈鳞癌基因表达谱的研究表明，VEGF-C是口腔鳞癌的差异表达基因。段丽琼等［7］应用实时定量PCR验证其在口腔鳞癌中表达升高，表明其与口腔鳞癌密切相关。本研究结果显示，口腔鳞癌组织中VEGF-C表达显著高于癌旁组织，且随着肿瘤的恶性程度的增高而增高，但与肿瘤的大小无关。
关于肿瘤细胞进入淋巴管的方式,目前尚存在不同观点［8］。一种观点认为，肿瘤细胞侵入肿瘤边缘已经存在的淋巴管而发生转移；而另一种观点则认为肿瘤可以促进新的淋巴管生成，并通过侵入这些新生的淋巴管而发生转移。本文结果提示，VEGF-C的高表达与口腔鳞癌的颈淋巴结转移密切相关。其可能的机制为：①肿瘤细胞通过旁分泌和一部分自分泌作用分泌VEGF-C,促进癌内和癌旁,尤其是癌旁淋巴管密度显著增加,导致口腔鳞癌颈淋巴结转移率增加; ②趋化因子VEGF-C改变了表达于淋巴管内皮细胞的黏附分子和原有的淋巴管功能,使肿瘤细胞的趋化性、淋巴管的侵入和播散变得活跃,具有良好趋化性的化学增活作用可能介导了肿瘤细胞的迁徙。
目前对于VEGF-C在早期口腔鳞癌病人（T1/T2N0）隐匿性淋巴结转移中的意义，尚存在不同意见〖9，10〗。FAUSTINO等［10］通过对87例临床上诊断为T1-T2N0M0，pN+或pN0的舌癌或口底癌病例进行免疫组化分析，其中在64例行颈清术的病人中发现24例有淋巴结转移，转移组与无转移组之间VEGF-C差别无统计学意义，这一结果与之前的研究结论［9］不同，需要进一步深入研究。
总之，口腔鳞癌组织中VEGF-C过度表达，提示VEGF-C诱导癌周淋巴管增生扩张是发生区域淋巴结转移的重要因素之一，VEGF-C有望成为早期判断和预测颈淋巴结转移的指标，如果在肿瘤早期拮抗VEGF-C的分泌或者阻断其与受体的结合，有可能达到减少肿瘤转移、改善预后的目的。
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［7］段丽琼,陈万涛,张明宾,等. 口腔颌面鳞状细胞癌相关基因的筛选与定量验证［J］. 中华口腔医学杂志, 2006,41(8):456-459.
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［10］FAUSTINO S E S, OLIVEIRA D T, NONOGAKI S, et al. Expression of vascular endothelial growth factor-C does not predict occult lymph-node metastasis in early oral squamous cell carcinoma［J］. Oral Maxillofac Surg, 2008,37:372-378.
作者单位：青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科,山东 青岛 266003