乳癌T47D细胞P物质和NK-1的免疫细胞化学检测

【摘要】  目的 探讨P物质及其受体神经激肽1 (NK-1)在体外培养的乳癌细胞系T47D中的表达及免疫细胞化学定位。方法 用放入盖玻片的6孔板进行细胞培养，第3天将盖玻片取出进行免疫细胞化学染色。结果在T47D细胞系中P物质和NK-1呈阳性表达。P物质阳性表达主要位于胞浆，而NK-1阳性表达主要位于胞膜和胞浆。结论 P物质和NK-1在绝大多数T47D细胞中呈阳性表达，提示神经内分泌机制参与了乳癌的发病过程。该研究揭示了T47D细胞系的一种新特性，并为乳癌的治疗提供了新的可能靶点。

【关键词】  乳腺肿瘤 T47D细胞系 P物质 受体 神经激肽1 免疫组织化学

P物质属于速激肽家族，它由TAC1基因编码，11个氨基酸组成［１］。它能够特异性结合并激活其受体神经激肽1 (NK-1)，后者属于7次跨膜G蛋白耦联受体［2］。NK-1 受体激活后，以G蛋白作为第二信使活化PKC和MAPK/ERK通路［3］。在人类存在两种亚型的NK-1：全长型(NK1-FL)和截短型（NK1-Tr）［4］。近年来发现，G蛋白耦联受体介导的信号转导通路参与了某些恶性肿瘤的发病过程。已有研究提示，在乳癌中可能存在P物质和NK-1的表达〖5,6〗，但目前对二者在T47D细胞系中的表达情况及免疫细胞化学定位尚不清楚。本文采用免疫细胞化学染色技术对体外培养的乳癌细胞系进行研究，探讨P物质和NK-1在T47D细胞系中的表达情况及免疫细胞化学定位。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    兔抗人P物质多克隆抗体购自北京中杉金桥生物公司（使用浓度1∶50），兔抗人NK-1多克隆抗体购自Millipore公司（和NK1-FL羧基端第393～407位氨基酸结合，使用浓度1∶700）。T47D细胞系购自中国科学院上海细胞库。正常山羊封闭血清、ElivisionTM试剂盒、DAB显色剂等购自福州迈新公司，DMEM（高糖）、胰酶（含0.5 g/L胰酶和0.53 mmol/L EDTA）购自Gibco公司，胎牛血清购自PAA公司， 25 cm2细胞培养瓶、6孔组织培养板、15 mL离心管购自Corning公司。PBS（pH值7.2～7.4）和盖玻片由青岛市市立医院病理科提供。

    1.2  细胞培养

    T47D细胞培养于含有体积分数0.10胎牛血清的培养液中，隔天换液。在细胞90％融合时将其接种于预先置入盖玻片的6孔板中，每孔细胞数约5×105个，置于37 ℃含体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养 (美国SHEL LAB公司)。在种板后第2天换液，第3天将盖玻片取出，置入4 ℃丙酮中固定15 min。

    1.3  免疫细胞化学染色

    免疫细胞化学染色采用Elivision两步反应系统，所有染色过程在室温下进行。细胞固定标本经PBS冲洗后先用体积分数0.30 H2O2孵育15 min，然后滴加非免疫山羊血清30 min封闭非特异性结合位点。一抗孵育1 h后，先后滴加试剂A（增强剂）和试剂B（辣根过氧化物酶聚合物），用DAB显色3 min。之后苏木精复染、盐酸乙醇分化、氨水返蓝、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。正常山羊封闭血清代替一抗做阴性对照。采用交通事故死亡尸检中提取的人脑组织切片作为阳性对照。

    1.4  结果判定

    所有染色标本用Olympus BX-51显微镜观察，阳性标准参照相关文献［7］。低倍镜下见到染成明显棕黄色的细胞为阳性。每个标本在高倍镜下（400倍）随机选取5个视野计数阳性细胞数。

    1.5  统计学分析

    统计学处理采用SPSS 12.0和PPMS 1.5［8］统计学软件。所得数据以±s表示，组间比较采用t检验。

    2  结    果

    2.1  P物质在T47D细胞系中表达的细胞学定位

    接种第3天T47D细胞贴壁良好，约30%融合，在盖玻片上呈树枝状，细胞呈多角形，界限不清。所有标本经免疫细胞化学染色后，绝大多数细胞中P物质均呈阳性反应，棕黄色颗粒主要位于胞浆。

    2.2  NK-1在T47D细胞系中表达的细胞学定位

    绝大多数细胞可见NK-1呈强阳性表达。与P物质相比，NK-1着色同时存在于胞浆和胞膜，部分细胞只有胞膜阳性。

    2.3  P物质与NK-1表达结果的比较

    阴性对照未见阳性着色，而P物质和NK-1在大部分T47D细胞中呈阳性表达，其阳性细胞计数结果分别为每高倍视野（72.00±5.77）、（76.02±9.55）个。P物质和NK-1阳性细胞计数结果之间比较无显著差异（t=1.139，P>0.05）。

    3  讨    论

    TAC1基因和NK-1广泛分布于神经组织和非神经组织［9］，它们参与了包括肿瘤在内的许多疾病过程［10］。各种肿瘤细胞胞膜表达的NK-1能够高度依赖于P物质的刺激，从而使细胞持续增殖。NK1-FL 和NK1-Tr都能引起Ca2+动员，PKC以及MAPK/ERK的活化。NK-1活化后以G蛋白为第二信使激活下游信号转导通路，其β和γ亚单位能够活化raf-1和ERK1/2而引起细胞的转化，不同条件下这条途径既可引起细胞增殖也可促进细胞的凋亡［11］。上世纪70年代人们就发现，许多神经内分泌肿瘤可以分泌P物质，而关于P物质受体特征和功能的研究报道，最早是在20世纪80年代后期见于星形细胞瘤［12］。直到近几年人们才逐渐对P物质及其受体在各种肿瘤中的表达情况展开研究，结果显示，许多肿瘤细胞胞膜表面的NK-1水平明显增高。本研究表明，P物质和NK-1在体外培养的乳癌细胞系T47D中均呈阳性表达，这与PETEL等［6］的报道相一致。由于P物质及NK-1与神经内分泌系统密切相关，该研究提示神经内分泌机制可能参与了乳癌的发病过程。此外，本研究结果证实，NK1-FL在T47D细胞系中细胞膜和胞浆内有大量表达，支持用RT-PCR的方法检测到乳癌中存在NK1-FL mRNA扩增的实验结论［5］。由于P物质能够上调NK1-Tr的水平， T47D细胞系中P物质强阳性也提示NK1-Tr的高水平表达。

    SINGH 等［5］认为，P物质刺激乳癌细胞的生长作用可能是通过它和一些细胞因子（IL-1、IL-6和SCF等）的共同作用引起。本研究结果也表明，在T47D乳癌细胞本身存在P物质的高表达，这提示P物质引起这些细胞因子分泌增多后，以自分泌方式刺激肿瘤细胞的生长。另外，PETEL等［6］报道在细胞培养上清液中存在P物质，这表明P物质也可能通过旁分泌方式上调并激活细胞膜上NK-1受体，从而激活下游信号转导通路引起肿瘤细胞的增殖。考虑到两种方式同时参与P物质对乳癌生长的影响过程，我们认为阻断其中每一种方式都可能起到生长抑制作用。

    此外，免疫组化法简单实用，用该法标记特定类型的肿瘤标志物一直是重要的辅助诊断手段〖13,14〗。本研究通过免疫组化法证明了上述两种神经内分泌指标在T47D细胞系的高表达，这为临床上具有该细胞系特点的乳癌提供了一种新的简单可靠的诊断指标。

    综上所述，本研究用免疫组化Elivison法明确了P物质和NK-1在乳癌细胞系T47D上的表达以及细胞定位，不但提供了T47D细胞系的一种新特性，也为新的抗肿瘤药物研究提供了理论基础。进一步研究P物质及其受体NK-1与T47D细胞系的关系，可以阐明二者在该类型乳癌中的作用，为乳癌的临床诊断提供新的指标。

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作者单位：青岛大学医学院，山东 青岛 266021