格列卫对慢性粒细胞白血病病人Ph染色体和bcr/abl融合基因表达影响

【摘要】  目的 探讨格列卫治疗Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病病人后骨髓Ph染色体及bcr/abl融合基因表达的变化。方法 采用R显带和半定量RTPCR分别检测11例慢性粒细胞白血病病人服用格列卫前后骨髓标本中Ph 染色体和bcr/abl基因的表达。结果 用药后9例慢性期慢性粒细胞白血病病人，7例分别在用药3～24个月后染色体检查为Ph染色体阴性，1例用药1个月后其Ph染色体仍为阳性，后失访；1例用药2个月后 Ph染色体阳性率为30%；1例急变期慢性粒细胞白血病病人用药6个月后其Ph染色体阳性率为70%；1例加速期慢性粒细胞白血病病人用药12个月后Ph染色体阳性率为60%。服用格列卫的CML病人Ph染色体转阴后仍能检测到bcr/abl基因的表达，但其表达水平较用药前明显降低，差异有显著性（t=3.77、5.13，P<0.01），随着用药时间的延长bcr/abl基因表达逐渐降低。结论 格列卫能有效治疗Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病病人，并且对其预后具有重要的意义。

【关键词】  白血病,髓样,慢性；费城染色体；格列卫；融合基因,bcr/abl；逆转录聚合酶链反应

THE EFFECT OF GLIVEC ON Ph CHROMOSOME AND bcr/abl mRNA EXPRESSION IN CHRONIC MYELOCYTIC LEUKEMIA LI PING, GUAN HONGZAI, YANG JIE, et al (Department of Hematology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the changes of Ph chromosome in bone marrow and bcr/abl mRNA levels in patients with chronic myeloid leukemia (CML) after treatment with Glivec. Methods By using Rbanding technique and semiquantitative RTPCR, Ph chromosomes and bcr/abl mRNA levels in bone marrow samples of 11 CML patients were detected before and after the administration of Glivec.  Results Of the nine patients, Ph chromosome was negative in seven after three to 24 months of treatment; one patient still showed positive Ph chromosome after onemonth medication and lost followup later; one patient showed the positive rate of Ph chromosome of 30%. The positive rate of Ph chromosome in one patient with blast crisis CML after sixmonth treatment was 70%. One patient with acceleratedphase CML after 12month treatment showed 70% of positive Ph chromosome. Although bcr/abl mRNA expression could still be detected in patients with CML even after Ph chromosome became negative, the level was significantly lower than that of before treatment (t=3.77,5.13;P<0.01). The level of bcr/abldecreased gradually along with the extention of medication.  Conclusion Glivec can effectively treat CML patients with positive Ph chromosome, which is of great significance of the prognosis of the disease.

    ［KEY WORDS］ Leukemia, myeloid, chronic; Philadelphia chromosome; Glivec; Fusion gene, bcr/abl; Reverse transcriptase polymerase chain reaction

    慢性粒细胞白血病（CML）是起源于造血干细胞的克隆性增殖性疾病。95%的CML病人有特征性的Ph染色体及其分子标志bcr/abl融合基因。研究证明，bcr/abl融合基因编码的具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白质是CML发生的主要原因[1]。目前，除了异基因造血干细胞移植外，常规药物治疗均不能有效延长CML病人的生命。直到2001年格列卫——一种酪氨酸激酶活性抑制剂的问世，才给CML病人带来了新的希望。本实验分别采用R显带和RTPCR技术检测格列卫治疗前后CML病人体内Ph染色体和bcr/abl融合基因的变化，以判断格列卫的疗效，并指导进一步的治疗。现将结果报告如下。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    2007年4月～2008年8月，来我院行染色体分析的CML病人11例，男6例，女5例；中位年龄43岁。其中CML慢性期（CMLCP） 9例，CML加速期（CMLAP）1例，CML急变期（CMLBP）1例，以上病人诊断和疗效判定均参照《血液病诊断及疗效标准》[2]。

    1.2  治疗方法

    本文11例CML病人均单独口服格列卫治疗，其中CMLCP病人剂量为400 mg/d，CMLBP病人剂量为400～600 mg/d，CMLAP病人剂量为400～600 mg/d，分2次饭后口服。

    1.3  疗效标准

    完全遗传学缓解（CCyR）：Ph阳性细胞为0；主要遗传学缓解（MCR）：骨髓中Ph阳性细胞为0～35%；血液学缓解（CHR）：外周血白细胞<10×109/L，血小板<300×109/L，无幼稚粒细胞，无髓外白血病细胞浸润。

    1.4  染色体制备与核型分析

    取适量骨髓，无菌接种于1640培养基内，37 ℃孵育24 h，加入秋水仙素，阻留中期分裂细胞，经低渗、预固定、固定等步骤收获细胞悬液；将细胞悬液滴片，采用R显带法显带后，用吉姆萨染色，分析20个分裂中期细胞，观察有无Ph染色体及其他异常核型。核型描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）1995》的要求。  

    1.5  RNA提取

    取骨髓液 2 mL,缓慢加于等量的人淋巴细胞分离液上，2 000 r/min 离心 15 min，分离单个核细胞，加入 Trizol 试剂1 mL，按照试剂说明书进行细胞总RNA 提取，使用紫外线分光光度计测定 RNA 纯度(A260/A280>1.60)，同时测定 RNA 浓度。在 15 g/L琼脂糖凝胶电泳下可见3 条清晰亮带，说明所提取 RNA 完整。

    1.6  RTPCR检测

    1.6.1  引物设计  bcr/abl融合基因引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，其上游引物的序列为5′CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG3′，下游引物的序列为5′CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA3′，扩增产物的长度分别为165、90 bp；以βactin为内参照，其上游引物的序列为5′AAACACCCCAGCCATGTACGT3′，下游引物的序列为5′GTGGTGGTGAAGCTGTAGC3′，扩增产物长度为228 bp。

    1.6.2  cDNA合成  按照逆转录试剂盒的操作步骤进行。反应总体系为20 μL，其中包含5 μg细胞总RNA，1 μL浓度为0.5 g/L的Oligo(dT)18，用DEPC处理的水将体积补充到12 μL，混匀，离心3～5 s，70 ℃孵育5 min，冰浴、离心；再分别加入5×Buffer 4 μL、20×106 U/L RNAsin 1 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL，轻轻混匀、离心，37 ℃孵育5 min；再加入2×108 U/L的MMuLV 1 μL。然后42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min进行逆转录。

    1.6.3  PCR扩增  PCR反应体系为20 μL，其中含有逆转录产物4 μL，2×PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，然后用DEPC处理的水补充体积至20 μL。内参照与目的基因分别扩增，反应条件均为94 ℃预变性2 min，94 ℃ 变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次后72 ℃延伸5 min。

    1.6.4  PCR产物分析  取PCR扩增产物10 μL，于20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳（60 V,60 min）后，进行凝胶成像分析。用Tanon Gis1000分别对各泳道进行灰度扫描，得出强度值和面积，分别用各泳道的强度值×面积即为灰度值，然后以目的基因与内参照βactin 的灰度比值进行半定量分析，每个标本扫描2次，取平均值。

    1.7  统计学处理

    实验结果以SPSS 11.5及PPMS 1.5[3]统计软件进行统计分析,用药前后比较应用配对t检验及卡方检验（四格表精确检验法）。

    2  结    果

    2.1  格列卫治疗后 Ph染色体的变化

    11例病人服用格列卫前Ph染色体阳性率均为100.0%，9例CMLCP病人分别服用格列卫3～24个月， 7例病人Ph染色体转为阴性，达CCyR；1例用药1个月后Ph染色体阳性率仍然为100%，但已经达CHR，后失访；1例用药2个月后Ph染色体阳性率为30%，达MCR。1例CMLBP病人用药6个月后其Ph染色体阳性率为70%。1例CMLAP病人用药12个月后Ph染色体阳性率为60%。格列卫治疗前后CML病人Ph染色体阳性细胞百分率比较差异有显著性（P=0.01）。见表1。

    2.2  格列卫对bcr/abl融合基因的影响

    用药前11例标本不同程度地表达bcr/abl融合基因，其中4例高表达长165 bp和90 bp两条扩增带；4例高表达长90 bp扩增带，低表达或不表达165 bp扩增带；3例高表达长165 bp扩增带，低表达长90 bp扩增带。格列卫治疗后的CML病人在其Ph染色体转阴后仍能检测出bcr/abl基因表达，其中4例低表达长90 bp和165 bp两条扩增带，4例低表达长90 bp扩增带，3例检测不到bcr/abl扩增带（图1）。

    用药前后CML病人长90 bp和165 bp bcr/abl基因表达量比较差异有显著性（t=3.77、5.13，P<0.01）。见表1。CMLCP病人bcr/abl降低水平高于CMLAP、CMLBP病人。

    M:Marker，①正常对照;②、③用药后CMLCP病人表达的bcr/abl融合基因;④、⑥用药前CMLCP病人表达的bcr/abl融合基因;⑤用药前CMLAP病人表达的bcr/abl融合基因;⑦用药前CMLBP病人表达的bcr/abl融合基因表1  格列卫治疗前后Ph阳性细胞百分率与bcr/abl融合基因表达水平时间nPh阳性细胞

    3  讨    论

    格列卫是治疗CML的一种新型特效药，它是一种2苯氨嘧啶衍生物，通过与ATP竞争性结合BCR/ABL融合蛋白，抑制其酪氨酸激酶活性，从而抑制其细胞信号传导途径，促使细胞凋亡和抑制Ph阳性白血病细胞的增殖，因此，格列卫是治疗CML的一种靶向药物，是CML治疗史上的里程牌，并且对CML具有很好的疗效。试验证实，格列卫能使41%干扰素治疗无效的Ph阳性CMLCP和76%初治CMLCP病人Ph染色体转阴，获得CCyR[4]。本实验研究结果表明，服用格列卫的11例CML病人中，9例CMLCP病人格列卫治疗3～24个月后， 7例达CCyR；1例用药1个月后Ph染色体阳性率仍然为100.0%，但已经达CHR，后失访；1例用药2个月后达MCR。1例CMLBP病人用药6个月后达CHR；1例CMLAP病人用药12个月后达CHR。该结果与KANTARJIAN 等[5]报道的结果一致，但高于其结果，这可能与本研究标本量少，观察时间短有关。

    PASCHKA等[6]报道，CML病人经格列卫治疗后Ph染色体已经消失甚至达CCyR时，很大一部分病人体内还能检测出bcr/abl mRNA，但是随着治疗时间的延长，bcr/abl mRNA呈下降趋势，直至检测不到。本实验结果显示，格列卫治疗3个月即能使Ph阳性染色体转阴，随着用药时间的延长Ph染色体转阴的比例升高，慢性期转阴的比率明显高于急变期和加速期，这与有关文献报道的结果一致[7]。Ph染色体转阴后仍能检测出bcr/abl基因表达，但其阳性表达率比用药前明显降低，其中资料完整的3例病人治疗6个月时的bcr/abl mRNA分别比用药前降低89.1%、83.6%、91.2%。该结果与文献报道的结果一致[8]。因此，病人在治疗达Ph染色体阴性甚至达CCyR后，仍需要继续服用格列卫治疗，同时可用RTPCR监测bcr/abl mRNA的水平及病情变化，从而达到更有效治疗CML的目的和预防耐药的发生。

    本实验结果表明，格列卫能有效治疗CML，尤其是对CMLCP的病人具有良好的疗效，这就给那些无法进行异基因造血干细胞移植的病人提供了生存的希望。

    温莉娟等[9]研究显示，不同CML病人体内表达的bcr/abl融合基因也不相同，有些病人则只表达长165 bp或90 bp中的一条扩增带，有些病人同时表达长165、90 bp两条带，这部分病人大多见于急性期。本实验结果显示，11例病人用药前4例同时表达长90、165 bp 扩增带，4例主要表达长90 bp扩增带，3例主要表达长165 bp扩增带。具体bcr/abl扩增带与CML分期的关系我们会在以后的研究中进一步探讨。

    总之，格列卫能有效地治疗CML病人，延长CML病人的生存期，改善其生活状况，提高生活质量，给CML病人带来了新的希望。

【参考文献】
  [1]穆会君,谢平,沈云峰,等. BCR/ABL融合基因和转录因子 FoxO3a在初发和急变慢性粒细胞白血病病人中的表达变化[J]. 南京医科大学学报, 2008,28(2):190193.

[2]张之南,沈悌. 血液病诊断及疗效标准[M]. 第3版. 北京:科学出版社, 2007:134138.

[3]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成及应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

[4]BRIEN S G, GUILHOT F, LARSON R A, et al. Imatinib compared with interferon and lowdose cytarabine for newly diagnosed chronicphase chronic myeloid keukemia[J]. N Engl J Med, 2003,348:9941004.

[5]KANTARJIAN H, SAWYERS C, MICHALLET M, et al. Interferon alfa2b combined with cytarabine versus interferon alone in chronic myelogenous leukemia[J]. N Engl J Med, 1997,337:645652.

[6]PASCHKA P, MULLER M C, MERX K, et al. Molecular monitoring of response to imatinib (Glivec) in CML patients with interferon alpha. Low levels of residual disease are associated with continuous remission[J]. Leukemia, 2003,17:16871694.

[7]江浩,陈珊珊,江滨,等. 格列卫治疗54例Ph阳性慢性髓细胞白血病[J]. 中华血液学杂志, 2003,24(6):281285.

[8]秦亚溱,阮瑞国,刘艳荣,等. 实时定量RTPCR监测慢性粒细胞白血病病人伊马替尼治疗过程中bcr/abl mRNA水平[J]. 中华血液学杂志, 2005,26(1):15.

[9]温莉娟,刘利明,孟昭彦,等. 53例慢性髓系白血病细胞遗传学和bcr/abl融合基因检测[J]. 中国优生与遗传杂志, 2006,14(3):2829.

作者单位：1 青岛大学医学院血液病学教研室，山东 青岛 266071； 2 青岛市市立医院检验科; 3 青岛大学医学院附属医院血液病研究室