siRNA沉默血管VEGFR1基因对乳癌生长抑制作用

【摘要】  目的 探讨应用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体1（VEGFR1） 基因对移植瘤生长的影响。方法 将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内，肿瘤长至一定大小时, 随机分为对照（A）组、转染试剂对照（B）组、siRNA治疗（C）组。于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000TM转染试剂和Lipofectamine 2000TM转染试剂包裹的VEGFR1 siRNA。22 d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小；用RTPCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR1 基因的表达。结果 与A、B组比较，C组移植瘤增长趋势受到明显抑制（F=158.18、55.72，q=11.39、14.05，P<0.01）；RTPCR结果表明，与A、B组比较，C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=385.06，q=33.43，34.52，P<0.01）；蛋白印迹法结果亦显示，C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=114.11，q=9.31，20.75，P<0.01）。A组和B组各指标差异无显著性（P>0.05）。结论 化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR1的表达, 抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长，是潜在的肿瘤治疗的新方法。

【关键词】  RNA,小分子干扰;RNA干扰；血管内皮生长因子受体1;乳腺肿瘤

THE EFFECT OF RNA SILENCING VEGFR1 GENE ON INHIBITION OF BREAST CANCER WANG MINGMING, GE YINLIN, OUYANG QIQI  (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); ［ABSTRACT］ Objective To study the effect of VEGFR1 gene in new vessels of implanted human breast cancer in nude mice of chemically modified siRNA on the growth of implanted tumor.  Methods Tumor tissue was implanted into the fat pad of mammary gland of the nude mice, which were randomized to groups A (control group), B (transfecting agent group) and C(siRNA therapy group) when the tumor reached a certain size. The tumors were respectively injected with PBS, transfecting agent (Lipofectamine 2000TM) and transfecting agent (Lipofectamine 2000TM) with VEGFR1 siRNA. All the animals were killed after 22 days.The tumors were removed, the size measured. The expression of VEGFR1 gene in cancer tissue was detected by RTPCR and Western blotting.  Results Compared with groups A and B, the growth of tumor in group C was obviously suppressed (F=158.18, 55.72;q=11.39，14.05；P<0.01). RTPCR result indicated that the expression of VEGFR1 mRNA in group C was markedly downregulated as compared with groups A and B (F=385.06;q=33.43，34.52；P<0.01), and the Western blotting also revealed the same result (F=114.11;q=9.31，20.75;P<0.01). No significant changes of above items were noted in groups A and B (P>0.05). Conclusion RNAi mediated by chemically modified siRNA can decrease VEGFR1 gene expression in vessels of implanted tumors in nude mice, inhibit the growth of new vessels and tumors, which is a potential therapy for tumor.

    ［KEY WORDS］ RNA, small interfering; RNA interference; Vascular endothelial growth factor receptor1; Breast neoplasms

    20 世纪70 年代初,FOLKMAN[1]首先提出了“肿瘤生长和转移都依赖于新生血管的形成”的概念,并得到大量实验结果的证实。肿瘤血管的形成依赖于多种相关因子的诱导和调节,其中血管内皮生长因子受体1 (VEGFR1) 在血管内皮和部分肿瘤细胞，特别是乳癌细胞上特异性表达,且表达量明显高于其他受体,对于VEGF 信号转导及血管生成起主导作用,在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用。RNA干扰(RNAi)是一项新兴的基因治疗技术[2]，是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程，是转录后基因沉默（PTGS）的一种。小干扰RNA(siRNA)是RNAi的效应分子，体外合成siRNA则是RNA干扰技术的最新发展,尤其在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面,为基因治疗开创了新的道路。然而，siRNA在活体内稳定性和靶向性的问题使其应用受到了限制[3]。本研究依据RNAi原理，设计合成针对人VEGFR1基因的siRNA，并行氟代化学修饰，增强其在体内抵抗核酸酶的稳定性。本实验在人乳癌裸鼠移植瘤模型中，应用siRNA沉默移植瘤血管中VEGFR1基因,通过抑制肿瘤血管生成而达到抑制肿瘤生长的目的，以探讨经过化学修饰的siRNA介导的RNAi作为肿瘤基因治疗的可行性及特异性。现将结果报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  BALB/c nu/nu裸鼠和SKBR3荷瘤裸鼠,购自上海斯莱克动物有限公司，雌性，4周龄，体质量12～16 g。按规定饲养于无菌动物实验室。经高压灭菌标准饲料和水供动物自由饮食。

    1.1.2  主要试剂  Lipofectamine 2000TM及TRIzol Reagent由Invitrogen公司生产；AMV逆转录试剂盒由Toyobo公司生产；抗VEGFR1多克隆抗体（rb1527）由NeoMarkers公司生产。

    1.2  方法

    1.2.1  siRNA设计与合成  首先在美国国立生物技术信息中心的NCBI数据库中获取人VEGFR1 mRNA全长序列 (GI：156104875)，利用siRNA在线设计软件及RNA二级结构分析软件structure 4.4确定VEGFR1 siRNA序列为：5′CAGGAUGGUAAAGACUACA3′(正义链)，5′GTCCTACCATTTCTGATGT3′(反义链)。行BLAST比对检查以保证和其他基因无同源性，并对VEGFR1 siRNA正义链行氟代修饰，反义链不修饰。

    1.2.2  乳癌原位移植模型的建立及分组与处理参照文献[4]的方法,将肿瘤直径2 cm的SKBR3荷瘤裸鼠处死，无菌条件下剥离瘤体并置生理盐水中，剔除包膜和结缔组织，将肿瘤组织切成2 mm×2 mm×2 mm大小组织块，对15只雌裸鼠进行接种。切开裸鼠右侧胸壁皮肤约1.0 cm，暴露第二对乳腺脂肪垫，将肿瘤组织块接种于其内，缝合切口。

    以瘤体直径≥5 mm为成瘤阳性，将成瘤阳性的裸鼠随机分为3组,每组5只。进行瘤内给药：C组分别注射VEGFR1 siRNA（1 mg/kg）以及Lipofectamine 2000TM和PBS溶液；B组分别注射Lipofectamine 2000TM和PBS溶液；A组仅注射PBS溶液。终体积均为100 μL。每3 d注射一次,连续8次。22 d后拉颈处死裸鼠。瘤组织加入液氮，匀浆提取RNA和蛋白。

    1.2.3  肿瘤体积与抑瘤率分析  瘤体积（V）计算公式如下：V=0.5a×b2(a为肿瘤长径,b为短径)，每3 d测量瘤体积1次，绘制瘤体增长曲线。22 d后拉颈处死裸鼠，计算抑瘤率。

    1.2.4  半定量RTPCR分析  按照Trizol试剂盒说明提取肿瘤组织总RNA,所提RNA溶于20 μL无酶水，Eppendorf核酸定量测定仪测定RNA浓度和纯度，并于8 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，观察RNA完整性。将5 μg总RNA在20 μL体系中行逆转录反应，取cDNA在25 μL体系中行PCR反应。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；然后，72 ℃延伸7 min。VEGFR1的上游引物: 5′CTAGATAGCGTCACCAGC3′，下游引物: 5′CTGTGATGTTGGGAGACG3′，扩增产物长为424 bp；内参照GAPDH的上游引物：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′,扩增产物长为226 bp。PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳并观察、拍照,应用天能分析软件对条带进行吸光（A）度扫描，检测各组VEGFR1 mRNA扩增产物与其对应的内参照GAPDH mRNA扩增产物A值，然后将AVEGFR1 /AGAPDH比值进行统计学分析。

    1.2.5  Western blotting方法检测VEGFR1蛋白的表达  充分研磨肿瘤组织，加入细胞裂解液冰上充分裂解，4 ℃下以12 000 r/min 离心5 min,收集上清液，定量。取100 μg蛋白于120 g/L的SDSPAGE上电泳, 蛋白充分分离后，转移到PVDF膜(Sigma 公司)上,于含50 g/L脱脂奶粉的封闭液中4 ℃过夜。加VEGFR1一抗（1∶200 稀释）室温孵育2 h,二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，DAB试剂对PVDF膜显色。对条带进行扫描，检测各组VEGFR1蛋白和内参βactin蛋白所对应条带A值，将AVEGFR1/Aβactin的比值进行统计学分析。

    1.3  统计学处理

    数据采用±s表示,经SPSS 12.0 及PPMS 1.5[5]统计软件分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。

    2  结    果

    2.1  裸鼠皮下移植瘤体积变化及抑瘤率

    与A、B组比较，C组第4、8天移植瘤增长受到明显抑制（F=158.18、55.72，q=11.39、14.05，P<0.01）。A组与B组相比差异无显著性（P>0.05）。C组肿瘤抑制率为54.03%。见表1。

    2.2  半定量RTPCR分析

    A、B、C组AVEGFR1/Aβactin比值分别为0.810±0.033、0.794±0.040、0.305±0.034。与A、B组比较，C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=385.06,q=33.43，34.52,P<0.01），A组与B组相比差异无显著性（P＞0.05）。表1  不同处理组移植瘤增长趋势

    2.3  蛋白印迹法检测VEGFR1 siRNA对靶蛋白表达的影响

    A、B、C组AVEGFR1/Aβactin比值分别为0.792±0.007、0.770±0.006、0.408±0.005，与A、B组比较，C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=114.11，q=9.31、20.75，P<0.01），A组与B组相比差异无显著性（P＞0.05）。

    3  讨    论

    早在20世纪70年代初就有人提出把抑制肿瘤血管形成作为肿瘤治疗的一个途径，随后这种以肿瘤血管为靶标的治疗策略——肿瘤血管靶向治疗逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。VEGFR1又称FLT1，是VEGF的特异受体。在将siRNA 分子开发为治疗疾病的药物分子时遇到的主要障碍是，如何有效地使其穿过细胞膜，并介导序列特异性的靶mRNA降解[6,7]。因此，对合成的siRNA 进行正确的化学修饰及应用合适的体内转导系统极有可能促进RNAi从体外到体内、从实验室到临床应用的转化。

    本实验依据RNAi原理，使用化学合成并对正义链进行氟代修饰的siRNA，参考文献[8,9]采用脂质体包裹法，在体外将siRNA与转染试剂混合，然后直接注射瘤体内。结果显示，C组瘤组织的增长受到明显抑制；RTPCR及蛋白印迹法结果表明，C组VEGFR1表达明显下调，而A组和B组各指标均无显著变化（P>0.05）。化学修饰的siRNA能够在体内有效下调内源性基因VEGFR1 的表达,抑制肿瘤的血管形成进而抑制肿瘤生长。

    总之,本研究证实，化学修饰的siRNA能够在体内有效下调内源性基因VEGFR1 的表达,通过抑制肿瘤的血管形成而抑制肿瘤生长,为肿瘤的基因治疗提供了一条新途径。

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作者单位：青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室，山东 青岛 266021