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首页医源资料库在线期刊齐鲁医学杂志2009年第24卷第4期

新城疫病毒对胃癌细胞抗原修饰作用的研究

来源:《齐鲁医学杂志》
摘要:【摘要】目的研究新城疫病毒(NDV)的抗原修饰作用在抗原致敏树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养NDV体外杀伤胃癌(SGC7901)细胞中所发挥的影响。方法从正常人外周血单个核细胞诱导DC、CIK细胞,用胃癌细胞SGC7901抗原致敏DC。致敏DC与CIK共培养,制备经胃癌抗原致敏的DC诱导CIK细胞(抗......

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【摘要】  目的 研究新城疫病毒(NDV)的抗原修饰作用在抗原致敏树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养NDV体外杀伤胃癌(SGC7901)细胞中所发挥的影响。方法 从正常人外周血单个核细胞诱导DC、CIK细胞,用胃癌细胞SGC7901抗原致敏DC。致敏DC与CIK共培养,制备经胃癌抗原致敏的DC诱导CIK细胞(抗原DCCIK)。MTT法检测抗原DCCIK对经与未经NDV作用的SGC7901细胞的杀伤效应,并观察阻断靶细胞表面非主要组织相容性复合体(MHC)后靶细胞杀伤效应的变化。结果 效靶比为20∶1时,联合应用 NDV前后,抗原DCCIK对胃癌细胞SGC7901杀伤活性分别为(69.3±1.5)%和(89.0±1.4)%,差异有显著意义(t=24.49,P<0.01);阻断靶细胞MHC分子后,抗原DCCIK对经与未经NDV作用的SGC7901细胞杀伤活性分别降低了30.8%和21.1%,与NDV修饰胃癌抗原的作用直接相关的特异性杀伤细胞对胃癌的杀伤效力约为9.7%。结论 抗原DCCIK并NDV是一种有效的抗胃癌生物治疗方式,NDV可对胃癌细胞抗原进行修饰,从而增强肿瘤细胞的抗原免疫反应性。

【关键词】  胃肿瘤;树突细胞;杀伤细胞;新城疫病毒

THE EFFECT OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS ON ANTIGEN MODIFICATION AGAINST GASTRIC CANCER   LI HUI, WANG ZHEN, MAO WEIZHENG, et al (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To investigate the effects of antigen modification of newcastle disease virus (NDV) on killing gastric cancer (SGC7901) in vitro. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors were induced to become dendric cells (DC) and CIK, using tumor antigen extracted from gastric cancer SGC7901 cells to sensitize DC, antigenpulsed dendritic cells were cocultured with CIK to generate CIK induced by gastric cancer antigenpulsed DC (antigenDCCIK). The lethal effect of SGC7901 cells which were modified or not modified by NDV was detected by MTT and the lethal effect on target cells after blockage of MHC molecule observed as well.  Results At 20∶1 effectortarget ratio, the cytotoxic activity of antigenDCCIK against SGC7901 modified or not modified by NDV was (89.0±1.4)% and (69.3±1.5)%, respectively (t=24.49,P<0.01), after target cell MHC molecule was blocked, the cytotoxic activity reduced by 30.8% and 21.1%, respectively, the specific cytotoxic activity directly related to cancer antigen modified by NDV was about 9.7%.  Conclusion AntigenDCCIK combined with NDV is an effective antigastriccancer biotherapy, NDV can modify the antigen of gastric cancer cell and enhance its antigen immunoreactivity.

    [KEY WORDS] Stomach neoplasms; Dendritic cells; Killer cells; Newcastle disease virus

    以细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)为免疫效应细胞治疗胃癌的研究已广泛开展。而用抗原致敏的树突状细胞(DC)诱导CIK能进一步增强CIK的杀伤作用,并表现出了特异性杀伤活性[1]。然而,肿瘤细胞的抗原大多较弱或隐含,大大削弱了免疫效应细胞对胃癌细胞的杀伤能力。因此,将抗原致敏的DC诱导CIK与具有显露肿瘤抗原能力的新城疫病毒(NDV)联合应用可以具有更强的杀伤效果。本实验通过比较联合应用NDV前后特异性杀伤活性的变化,分析NDV显露胃癌抗原的作用。现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂

    人重组白细胞介素2(rhIL2)、CD3单抗人重组GMCSF(rhGMCSF)、人重组IL4(rhIL4)、肿瘤坏死因子(TNFα)、干扰素(IFNγ)购自Peprotech 公司;Ficoll淋巴细胞分离液购自军事医学科学院;PBS缓冲液购自北京中山生物技术有限公司;鼠抗人HLAA、B、C,鼠抗人HLADP,鼠抗人HLADR抗体购自Biolegend公司;胎牛血清FCS购自杭州四季青生物制品公司;RPMI1640培养基购自Gibco公司;MTT液购自Sigma公司;CD3FITC/CD56PE鼠抗人单克隆抗体购自BioVision公司;NDV Lasota株,由中国动物卫生与流行病中心主任王克亮教授馈赠;人胃癌细胞SGC7901由我院肿瘤研究室提供。

    1.2  冻融法制备SGC7901胃癌细胞抗原

    收集对数生长期的SGC7901细胞,用PBS液调整细胞密度为1×1010/L,封装入冻存管。置液氮内冷冻10 min,放入37 ℃水浴中静置10 min,重复3次。再经10 000 r/min离心30 min,取其上清置-20 ℃保存备用。

    1.3  抗原DCCIK的制备

    取健康志愿者外周静脉血50 mL,肝素化,用PBS液1∶1稀释后与Ficoll液混合离心收集单个核细胞(PBMC)。加入含体积分数0.10 FCS的RPMI1640培养基,调整细胞密度为2×109/L,移入T25培养瓶中,置37 ℃、体积分数0.05的CO2细胞培养箱中培养2 h后,收集非贴壁细胞,作为CIK的前体细胞。贴壁细胞采用含0.2 mg/L的rhGMCSF、10×105U/L rhIL4和体积分数0.10的FCS的RPMI1640培养基于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养温箱中培养,每3 d半量换液。培养的第5天,在贴壁细胞培养瓶中每瓶加入0.5 mL肿瘤抗原。培养的第6天,在加入肿瘤抗原的培养瓶中每毫升培养基加入1 000 U TNFα。继续培养24 h后,获得抗原致敏的DC。收集非贴壁细胞,用含体积分数0.10的 FCS的RPMI1640培养基调整细胞密度为1×109/L,移入T25培养瓶中,同时每毫升培养基中加入1 000 U的IFNγ,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养24 h后,每毫升培养基中加入CD3单抗50 ng和1 000 U的rhIL2。每3 d半量换液,同时补足CD3单抗及rhIL2。培养的第7天将抗原致敏的DC与部分CIK以1∶3的比例混合,以CIK培养液继续培养7 d收获抗原DCCIK。

    1.4  抗原DCCIK的表型检测

    光镜下观察抗原DCCIK的形态;培养的第14天以流式细胞仪分析荧光染色标记抗原DCCIK细胞表型CD3/CD56。

    1.5  MTT比色法测定效应细胞体外杀伤活性

    取对数生长期的SGC7901细胞各100 μL,接种于96孔板中,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养,其中经NDV作用组加入20 μL的NDV(1∶1 024)作用4 h,待细胞长成单层后,MHC分子阻断组加入20 mg/L的鼠抗人HLAA、B、C、HLADP、HLADR各20 μL,MHC分子非阻断组及对照组加60 μL的PBS,37 ℃下作用1 h。调整效应细胞至所需密度,按效靶比为20∶1加入效应细胞,每种分组设3个复孔,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养20 h后,采用MTT比色法测定各组效应细胞的杀伤活性。将该实验在相同条件下重复3次,计算其杀伤活性。杀伤活性=1-实验孔A值×效应细胞对照孔A值靶细胞对照孔A值×100%。

    1.6  统计学方法

    使用SPSS 12.0及PPMS 1.5[2]统计软件进行数据处理,计量资料以±s表示,统计处理采用t检验

    2  结    果

    2.1  抗原DCCIK细胞表型分析

    流式细胞仪分析表明,培养14 d时,抗原DCCIK细胞群中CIK特征性细胞表型CD3+  CD56+双阳性细胞所占比例可达(36.3±3.5)%。 

    2.2  联合应用 NDV前后抗原DCCIK的体外细胞毒活性

    MTT 比色法测定抗原DCCIK组和NDV+抗原DCCIK组对胃癌细胞SGC7901的杀伤活性显示,在效靶细胞比为20∶1时,联合应用 NDV前抗原DCCIK对SGC7901肿瘤细胞的杀伤活性为(69.3±1.5)%,联合应用 NDV后抗原DCCIK对SGC7901肿瘤细胞的杀伤活性可达到(89.0±1.4)%,杀伤活性明显增强(t=24.49,P<0.01)。

    2.3  靶细胞MHC分子阻断对NDV+抗原DCCIK和抗原DCCIK体外细胞毒活性的影响

    阻断靶细胞MHC分子后,NDV+抗原DCCIK联合组对胃癌细胞SGC7901的杀伤活性由(89.0±1.4)%降为(58.2±1.7)%,杀伤活性降低了30.8%;抗原DCCIK组对SGC7901肿瘤细胞的杀伤活性由(69.3±1.5)%降为(48.1±1.5)%,杀伤活性降低了21.1%。联合应用 NDV后抗原DCCIK中特异性杀伤细胞对靶细胞的杀伤活性增加了约9.7%。

    3  讨    论

    体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法是继手术、放疗、化疗之外的另一种肿瘤治疗方法。CIK是将人外周血PBMC在体外用多种细胞因子诱导而获得的以CD3+ CD56+双阳性细胞为主的异质细胞群,是一种具有广谱杀瘤活性的MHC限制性免疫效应细胞[3,4]。DC是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞,可有效激发T细胞应答, 从而引发一系列的免疫应答[5]。利用肿瘤抗原致敏的DC与CIK共同培养可充分利用DC的作用,获得负载肿瘤相关抗原的抗原DCCIK细胞,可以提高CIK对肿瘤的杀伤效果,并表现出了特异性杀伤活性[6]。然而,肿瘤细胞表面存在的肿瘤相关抗原大多较弱或隐含,不足以引起宿主有效的抗肿瘤免疫反应并且使其能逃避免疫效应细胞杀伤,故仅注重免疫效应细胞杀伤能力的增强在抗肿瘤治疗中疗效大打折扣。NDV是副黏病毒科腮腺炎病毒属的成员,NDV能够特异性感染肿瘤细胞,而对人的正常细胞则没有杀伤作用[7]。NDV不仅有直接杀伤肿瘤细胞和调节机体免疫的作用,而且其在肿瘤细胞内复制使细胞表面产生了大量病毒表达的血凝素神经氨酸酶(HN),该酶可使肿瘤细胞表面的唾液酸量减少,暴露出隐藏的抗原决定簇,从而增加了肿瘤细胞的免疫反应性,使特异性杀伤细胞有更多的杀伤靶点[8]。先用NDV显露肿瘤抗原后再用抗原DCCIK细胞杀伤肿瘤无疑可起到抗肿瘤协同作用。本实验结果证实,抗原DCCIK联合应用NDV体外对胃癌细胞杀伤活性可达89%,是一种有效的抗肿瘤生物治疗方式。

    本实验用鼠抗人HLA抗体阻断胃癌靶细胞MHC分子,阻止特异性杀伤细胞与肿瘤细胞表面的MHC抗原肽复合物识别,从而阻断特异性杀伤细胞对靶细胞的杀伤活性。结果显示,阻断靶细胞MHC分子后,NDV+抗原DCCIK组对SGC7901肿瘤细胞杀伤活性降低了30.8%,抗原DCCIK组对SGC7901肿瘤细胞杀伤活性降低了21.1%。提示抗原DCCIK联合应用 NDV后,特异性杀伤细胞对靶细胞杀伤活性明显增加。体外实验不存在NDV影响机体免疫能力的因素,联合应用 NDV前后抗原DCCIK中特异性杀伤细胞的性质和数量并没有变化,因此NDV修饰胃癌细胞抗原使肿瘤抗原显露增加与特异性杀伤活性增加直接相关。

    本研究证实,抗原DCCIK联合应用NDV是一种有效的抗肿瘤生物治疗方式,联合应用NDV,除了NDV自身对肿瘤的杀伤作用外,还具有修饰胃癌细胞抗原增强其抗原免疫反应性的作用,可显著增加特异性杀伤细胞对肿瘤的杀伤能力,与NDV修饰胃癌抗原的作用直接相关的特异性杀伤细胞对胃癌的杀伤效力约为9.7%。

【参考文献】
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作者单位:1 青岛大学医学院附属医院普外科,山东 青岛 266003; 2 山东省青岛疗养院

作者: 2009-8-25
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