子宫内膜癌组织Syk基因的表达及其甲基化分析

【摘要】  目的 探讨脾酪氨酸激酶（Syk）基因在子宫内膜癌组织表达及该基因启动子甲基化与子宫内膜癌发生、发展的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应检测52例子宫内膜癌组织及其癌周正常组织中Syk基因的表达，同时采用巢式双重甲基化特异性PCR（MSP）方法检测该基因启动子甲基化情况。结果 Syk基因在子宫内膜癌中的表达显著低于相应的癌周正常组织（P=0.000）；子宫内膜癌有淋巴结转移组Syk基因表达率显著低于无淋巴结转移组（χ2=8.32，P<0.01）。Syk基因启动子甲基化发生率在子宫内膜癌组织中明显高于相应的癌周正常组织（P=0.000）；子宫内膜癌有淋巴结转移组Syk基因启动子甲基化发生率显著高于无淋巴结转移组（χ2=8.15,P<0.01）；发生甲基化的肿瘤组织中，均无Syk mRNA的表达。结论 Syk基因启动子甲基化可能是导致Syk基因失活的原因之一，Syk基因启动子甲基化可能与子宫内膜癌发生发展有关。

【关键词】  子宫内膜肿瘤；脾酪氨酸激酶；基因,肿瘤抑制；DNA甲基化

ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF Syk GENE AND ITS METHYLATION IN ENDOMETRIAL CARCINOMA CHEN RONGHUI, ZHAO SHUPING, MA DEHUA, et al (Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression of Syk gene in endometrial carcinoma (EC) and the relationship between hypermethylation of Syk gene promoter region and oncogenesis and development of the malignancy. Methods RTPCR was used to analyze Syk gene expression in EC tissue and normal paraneoplastic tissue in 52 patients, and Nest duplicated methylationspecific PCR (MSP) to detect methylation of Syk gene promoter region.  Results The rate of Syk expression in EC was lower than that in adjacent normal tissue (P=0.000); it was also lower in lymphnode metastasis than that without (χ2=8.32,P<0.01). The rate of methylation of Syk gene promoter region in cancer tissue was higher than that in normal adjacent tissue (P=0.000). It was higher in EC with lymphnode metastasis than that without (χ2=8.15,P<0.01). The expression of Syk mRNA was not detected in methylated tumor tissue.  Conclusion Hypermethylation of Syk gene promoter region may be one of the reasons of Syk gene inactivation, which may be related to oncogenesis and development of endometrial carcinoma.

    ［KEY WORDS］ Endometrial neoplasms; Spleen tyrosine kinase; Gene, tumor suppressor; DNA methylation

    子宫内膜癌是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，发病率呈明显增高趋势[1]。有学者认为COX2的上调表达与子宫内膜早期病变进展有关系，其对于子宫内膜癌的早期防治具有意义[2]。与子宫内膜癌相关癌基因如过度表达的AIB1基因、间皮素mRNA，被认为可能是子宫内膜癌变的促发因素之一，其涉及病人临床预后[3,4]。近年来，脾酪氨酸激酶（Syk）基因引起了国内外学者的重视，认为Syk基因是一种新发现的候选抑癌基因，其失活可能与肿瘤的发生有关，其启动子甲基化可能是基因失表达的重要原因，但目前在子宫内膜癌中尚无相关研究。本实验拟通过RTPCR和甲基化特异性PCR检测Syk基因在子宫内膜癌及癌旁组织中的表达情况及其甲基化状态，探讨Syk基因启动子甲基化在子宫内膜癌中的作用和意义。

    1  材料和方法

    1.1  标本

    选取我院2005年1月～2007年6月手术切除的子宫内膜癌病人标本52例（包括原发肿瘤病灶和距癌灶2 cm的癌旁正常组织）,病人年龄38～72岁，中位年龄52岁。按照FIGO （2000年）子宫内膜癌分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期15例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例；组织学分级：G1级18例，G2级24例，G3级10例。术后病理证实肌层浸润深度＞1/2者 29例，≤1/2者 23例；有淋巴结转移8 例，无淋巴结转移44例。取得标本迅速置液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存备用。所有标本均经病理检查证实，临床资料完整，术前均未经放疗、化疗及性激素治疗。

    1.2  主要试剂

    RNA 抽提及RTPCR试剂盒均购自大连宝生物公司，DNA提取试剂盒购自上海华舜试剂公司，甲基化修饰及纯化试剂盒为美国EPIGENTEK公司产品。

    1.3  RNA提取

    取100 mg标本应用RNA提取试剂盒、按说明书要求提取RNA，于紫外线分光光度计上测A260/A280定量并检测其纯度，-70 ℃冰箱保存待用。

    1.4  RTPCR反应

    取 1 μg总RNA逆转录为cDNA 后，取2.0 μL cDNA 为模板于20 μL体系进行PCR 扩增。引物由上海生物工程公司合成，Syk引物序列：Primer1 5′TTCTCCAGCAAAAGCGATGTCT3′，Primer2 5′TTTCCACATCGTATGTCCAGCA3′，产物长度199 bp。反应参数：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s、57 ℃30 s、72 ℃ 30 s, 30 个循环,最后72 ℃延伸10 min。内参照GAPDH引物序列：Primer1 5′TCATGGGTGTGAACCATGAGAA3′， Primer2 5′GGCATGGACTGTGGTCATGAG3′， 产物长度115 bp。反应参数：95 ℃ 15 min,95 ℃ 1 min、62 ℃1 min、72 ℃ 1 min、30 个循环,最后72 ℃延伸10 min取。取3 μL的PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下经Biocaptmw软件分析进行半定量分析。

    1.5  DNA 的准备和巢式双重甲基化特异性PCR（MSP）检测

    取50～100 mg标本按照DNA提取试剂盒的说明书提取DNA，测定A值确定其浓度和纯度。DNA甲基化修饰严格按照试剂盒上的说明进行。修饰的DNA应用PCR试剂盒进行MSP,首轮PCR的引物为:5′GATTAAGATATATTTTAGGGAATATG3′(sense),5′CACCTATATTTTATTCACATAATTTC3′(antisense),扩增产物长为600 bp。PCR反应条件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s、57 ℃30 s、72 ℃ 30 s,35个循环,最后72 ℃延伸10 min。取首轮PCR产物1.0 μL进行第2轮双重PCR检测。甲基化特异性引物为:5′CGATTTCGCGGGTTTCGTTC3′(sense),5′AAAACGAACGCAACGCGAAAC3′(antisense),扩增产物长为243 bp,包含9个CpG岛。非甲化基特异性引物为: 5′ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG3′(sense), 5 ′ACTTCCTTAACACACCCAAAC3′(antisense)， 扩增产物长为140 bp,包含8 个CpG 岛。甲基化和非甲基化的引物置于同一个反应中进行扩增,反应条件除甲基化的退火温度为59 ℃ 30 s、非甲基化的退火温度为54 ℃ 30 s、25个循环外,其他均与首轮PCR 条件相同。取第2轮PCR 产物2.0～5.0 μL，经过20 g/L琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后,在凝胶成像系统下观察成像结果。在双重PCR 产物中,若出现为243 bp的产物,则为Syk基因存在甲基化；若出现为140 bp的产物,认为基因存在非甲基化。

    1.6  统计学方法

    应用SPSS 11.5及PPMS 1.5[5]软件进行统计学处理,组间比较采用χ2检验和Fisher检验法。

    2  结    果

    2.1  Syk基因在子宫内膜癌和癌旁组织中的表达

    在52例子宫内膜癌组织中，40例未检测到Syk mRNA的表达，而在相应的癌旁组织中均可以检测到Syk基因的表达（图1），子宫内膜癌组织中Syk mRNA的表达率明显低于相应的癌周组织(P=0.000)。有淋巴结转移的8例子宫内膜癌中，仅1例检测到Syk基因的表达，而无淋巴结转移的44例中有11例检测到Syk基因的表达，无淋巴结转移组Syk基因的表达率高于有淋巴结转移组(χ2=8.32,P<0.01)。

    2.2  Syk基因启动子甲基化在子宫内膜癌中的发生率

    52例子宫内膜癌组织中有19例（32.6%）检测到Syk基因启动子的甲基化,而癌旁组织中均未发现有Syk基因启动子的甲基化（图2）, Syk基因启动子甲基化率在子宫内膜癌组织中明显高于癌旁组织 (P=0.000)。 发生淋巴结转移的8例子宫内膜癌中，7例可见Syk基因启动子甲基化，而无淋巴结转移的44例，仅有12例可检测到Syk基因启动子甲基化，有淋巴结转移组Syk基因启动子甲基化率明显高于无淋巴结转移组(χ2=8.15，P<0.01)。发生甲基化的肿瘤组织中均无Syk mRNA的表达。

    3  讨    论 

    近年来研究认为，Syk可能是一种候选抑癌基因，该基因失活在多种恶性肿瘤的病理过程中可能起着极为重要的作用，Syk可能具有抑制细胞分裂和增殖[6]、影响细胞因子分泌及细胞迁移、抑制肿瘤细胞成瘤能力[7]等生物学作用。 Syk的表达与多种细胞功能及恶性肿瘤播散、发病机制有关，是控制细胞生理功能的关键分子[8]。

    大量研究认为，Syk的缺失会导致免疫细胞发育、成熟障碍, 因而Syk的缺失可能与肿瘤的发生有关。本研究对Syk和子宫内膜癌的关系进行了探索，结果显示Syk mRNA在子宫内膜癌组织的表达显著低于癌周正常组织，这与COOPMAN等[9]研究结果相符。提示Syk mRNA 的表达缺失可能与子宫内膜癌的发生有关，可能是通过导致机体免疫细胞成熟障碍，使机体失去了对变异细胞的监测和杀灭作用,从而导致肿瘤的发生。同时本研究显示，无淋巴结转移组Syk mRNA的表达率显著高于有淋巴结转移组，提示Syk mRNA的表达缺失可能与子宫内膜癌的脉管转移有关，这与CARTER等[10]研究结果相符，后者认为Syk 可抑制HER2/neu的收缩脉管内皮细胞作用,从而抑制肿瘤的转移。

    近年来研究表明,基因 5′端CpG岛甲基化可能是肿瘤抑制基因失活的主要原因，该部位基因的甲基化可导致基因表达的异常调节。本研究通过Syk基因启动子甲基化的检测显示，在子宫内膜癌组织中Syk基因启动子甲基化率明显高于相应的癌旁组织，Syk基因启动子甲基化与Syk基因的表达水平变化趋势呈反相相关，发生甲基化的组织中Syk mRNA 的表达缺失，而未发生甲基化的组织中Syk mRNA 均有表达，提示子宫内膜癌中Syk基因的缺失可能是通过Syk启动子甲基化而实现的，该基因启动子甲基化可能是子宫内膜癌发生、发展过程中的重要机制之一。在乳癌、肝癌、结直肠癌中也已得出类似的结论[11～13]。本文结果还显示，子宫内膜癌中Syk基因启动子甲基化与子宫内膜癌的淋巴结转移密切相关，提示Syk基因启动子甲基化可能是子宫内膜癌发生侵袭及远处转移的一种机制。

    总之，Syk基因的缺失或低表达可能与子宫内膜的恶变及淋巴结转移密切相关，Syk基因启动子甲基化可能是该基因表达缺失的重要原因，Syk 基因启动子甲基化有可能成为子宫内膜癌的肿瘤标记,从而为评估肿瘤风险、制定预防策略、获得早期诊断和跟踪肿瘤预后提供指导，为子宫内膜癌的靶向基因治疗提供新的生物治疗靶点。

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[9]COOPMAN P J, DO M T, BARTH M, et al. The Syk tyrosine kinase suppresses malignant growth of human breast cancer cells[J]. Nature, 2000,406(6797):742747.

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作者单位：青岛大学医学院附属医院妇科，山东 青岛 266003