低剂量辐射对小鼠S180肉瘤组织EPO和VEGF表达影响

【摘要】  目的 观察低剂量照射（LDR）对荷S180肉瘤小鼠一般状态的影响，探讨其抑瘤机制及对肿瘤组织中促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生成因子（VEGF）的影响。方法 昆明小鼠皮下接种S180肉瘤细胞，待肿瘤形成后第12天，将小鼠随机分为假照（A）组及LDR组。对LDR组小鼠一次性给予75 mGy 60Co射线全身照射，A组行无射线假照射。A组于照射后6 h处死，LDR组分别于照射后6 h(B组)、12 h(C组)、24 h(D组)、48 h(E组)及72 h(F组)处死。分别取瘤称瘤质量,免疫组化方法检测两组肿瘤组织中EPO及VEGF的表达情况。结果E、F组与A组小鼠的瘤质量比较,差异有显著性（F=3.90,q=4.525、4.551，P<0.05）。A组肿瘤组织中EPO的阳性率与E、F组比较，差异有显著性（F=16.26,q=6.600、7.554,P<0.01）。LDR各组肿瘤组织中VEGF的阳性率与A组比较差异亦有显著性（F=47.27,q=2.777～14.668,P<0.05）。结论 LDR可降低小鼠的瘤质量，说明其在一定程度上抑制肿瘤的生长;LDR可降低VEGF、EPO表达，从而抗血管生成，抑制肿瘤生长和转移。

【关键词】  肉瘤180；红细胞生成素；血管内皮生长因子；全身照射

THE EFFECT OF LOWDOSE RADIATION ON EPO AND VEGF OF TUMOR IN S180 SARCOMABEARING MICE  JU BO, YU HONGSHENG, HAO PEI (Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To observe the effect of lowdose radiation (LDR) on general condition of sarcomabearing mice and investigate its effect on EPO and VEGF as well as its tumor inhibition.  Methods Subcutaneous inoculation with S180 sarcoma cells was done in Kunming mice,which were  randomized to shamradiation (SR) group and LDR group on day 12 after tumor formation. The mice in LDR group were given 75 mGy totalbody γray radiation, and those in SD group received noray radiation. The mice in SD group were sacrificed six hours after the radiation, and those in LDR group killed at 6h (group B), 12 h (group C), 24 h (group D), 48 h (group E) and 72 h (group F), respectively. The tumor weight was measured, and the expressions of EPO and VEGF were detected immunohistochemically.  Results The tumor weight of mice in groups E and F was statistically different compared to that in group A (F=3.90;q=4.525,4.551;P<0.05). A comparison between the positive EPO in tumor of group A  and that of groups E and F showed significant difference (F=16.26;q=6.600,7.554;P<0.01); the VEGF expressions in LDR groups were different as compared with that in group A (F=47.27,q=2.777－14.668,P<0.05).  Conclusion LDR can lower the weight of tumor, indicating that LDR, in some extent, inhibit the expressions of EPO and VEGF, thus restrain angiogenesis, the growth and metastasis of the tumor.

    ［KEY WORDS］ Sarcoma 180; Erythropoietin; Vascular endothelial growth factor; Wholebody irradiation

    近年来研究表明，恶性肿瘤的发生发展与机体的免疫功能失调或降低有密切的关系[1,2]。因此，有效地提高肿瘤病人的免疫功能是抗肿瘤治疗重要手段。低剂量辐射(LDR) 是指照射剂量在0.2 Gy 以内的低LET射线或0.05 Gy 以内的高LET射线,同时剂量率在0.5 mGy/min 以内。大量动物实验和基础研究证实，低剂量全身照射通过免疫刺激作用增强机体免疫、改变细胞周期分布、调节凋亡相关因子的表达等生物效应产生抑瘤作用，LDR可诱导广泛的适应性反应，表现为低剂量照射所致的染色体损伤、基因突变、细胞死亡及肿瘤发生率明显下降等，它对生物的生长发育、营养物质的利用、抗感染及抗肿瘤等有益。近年来，促红细胞生成素（EPO）及新生血管在肿瘤的生长、浸润、转移及其治疗中的作用备受关注。本实验用低剂量60Co射线全身照射S180肉瘤小鼠，检测其对S180肉瘤小鼠肿瘤组织中促红细胞生成素（EPO）、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，并观察其抑瘤效果。现将结果报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料来源

    1.1.1  实验动物  4～6周龄SPF级昆明小鼠58只，雄性，体质量20～22 g，购自青岛市药物研究所，许可证号：SCXK（鲁）20030010。S180肉瘤小鼠2只，由山东省医科院药物研究所提供，腹水传代，第二代用于实验。

    1.1.2  试剂  PV9000 二步法免疫组化试剂盒、羊抗促红细胞生成素（EPO）单克隆抗体、羊抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  荷瘤小鼠模型的建立  无菌条件下采集荷S180肉瘤种鼠淡黄澄清腹水2 mL，用无菌生理盐水稀释，锥虫蓝染色检测细胞成活率＞95%时，用无菌生理盐水调细胞密度至1×1013/L。实验小鼠左后肢皮肤消毒，于腹股沟皮下接种0.2 mL肿瘤细胞悬液。

    1.2.2  分组及处理  待肿瘤形成后第12天，将小鼠随机分为假照（A）组及LDR组。对LDR组小鼠一次性给予75 mGy 60Co射线全身照射，A组行无射线假照射。A组于照射后6 h处死，LDR组分别于照射后6(B组)、12(C组)、24(D组)、48(E组)及72 h(F组)处死。分别取瘤称瘤质量,免疫组化方法检测各组肿瘤组织中EPO及VEGF表达情况。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知的阳性切片作为阳性对照。

    1.3  结果判定

    EPO主要表达于肿瘤细胞的胞浆,以细胞浆呈棕色颗粒状染色为阳性表达。VEGF主要表达于细胞浆, 以细胞浆显示棕黄色颗粒为阳性表达。每只动物随机选取5张切片，显微镜下每张切片随机观察10个高倍视野（400倍），每个视野观察100个细胞，分别计数EPO、VEGF阳性细胞的表达率。EPO、VEGF阳性细胞的表达率=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。

    1.4  统计学处理

    采用SPSS 11.5及PPMS 1.5[3]统计软件进行统计学处理。

    2  结    果

    E、F组与A组小鼠的瘤质量比较,差异有显著性（F=3.90,q=4.525、4.551，P<0.05）。A组肿瘤组织中EPO的阳性率与E、F组比较，差异有显著性（F=16.26,q=6.600、7.554,P<0.01）。LDR各组肿瘤组织中VEGF的阳性率与A组比较差异亦有显著性（F=47.27,q=2.777～14.668,P<0.05）。见表1。表1  各组瘤质量及EPO、VEGF表达的比较

    3  讨    论

    肿瘤发生、侵袭、转移能力与肿瘤的促血管形成密切相关。研究表明, 肿瘤直径达1～2 mm后, 要继续发展,必须有足够的营养供应,这样便需要形成供应肿瘤生成的新生血管[4,5]。肿瘤血管的新生, 一方面为肿瘤生长提供营养, 另一方面增加了血管的通透性, 有利于肿瘤细胞转移。肿瘤微血管数量愈多, 肿瘤细胞进入血液循环的机会愈大。持续无规则的新生血管的形成促进了肿瘤的生长、侵袭与转移。在体内, 肿瘤的血管新生因子主要来源于肿瘤细胞, 肿瘤细胞可分泌释放多种活性因子,刺激血管内皮细胞的生长和迁移。其中, 肿瘤细胞产生的VEGF 是目前已知在血管新生中作用最强的血管新生促进因子。大量研究结果表明, 许多肿瘤组织都有VEGF 的高表达[6], 这说明在肿瘤生长过程中, VEGF 参与了血管新生过程, 对肿瘤的生长和转移发挥了重要的意义。肿瘤是典型的血管依赖性病变, 即恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤组织血管新生。抑制肿瘤血管新生也就抑制了肿瘤的生长和转移。在众多与血管新生有关的因子中, VEGF在肿瘤新生血管形成过程中起着重要作用, 抑制VEGF表达成为抗肿瘤治疗的新方法。大量研究证实, EPO能够诱导VEGF的高表达，从而促进肿瘤细胞的生长播散及复发[7]。本研究采用LDR肿瘤的方法观察其对肿瘤生长及VEGF、EPO表达的影响。结果显示，A组与E、F组瘤质量比较差异均有显著意义，A组肿瘤组织中EPO的阳性率与E、F组比较差异有显著性，LDR各组肿瘤组织中VEGF的阳性率与A组比较差异均有显著意义，说明LDR在一定程度上抑制了肿瘤的生长;而且LDR可降低VEGF、EPO表达，从而起到抗血管生成、抑制肿瘤生长和转移的作用。

    总之，LDR可降低小鼠的瘤质量、抑制EPO及VEGF的表达，具有抗血管生成的作用，从而为肿瘤的治疗提供了新的思路。

【参考文献】
  [1]侯继院,沈方臻,王延涛,等. 顺铂低剂量节律化疗抑制小鼠H22 肝癌血管生成观察[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(2): 9598.

[2]刘静,于洪升,朱静娟. 低剂量辐射对环磷酰胺所致小鼠DNA及遗传物质损伤的影响[J]. 青岛大学医学院报, 2008,44(1):4447.

[3]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

[4]曹宁川,杨向红. 肿瘤细胞对体外诱导人内皮细胞血管形成的影响及VEGF 的作用[J]. 中国医科大学学报, 2008,37(3):405407.

[5]许明月,赵发. VEGFC 与肿瘤淋巴转移[J]. 现代中西医结合杂志, 2008,17(16):25782580.

[6]JAYSON G C, MULATERO C, RANSON M, et al. Phase Ⅰ investigation of recombinant antihuman vascular endothelial growth factor antibody in patients with advanced cancer[J]. Eur J Cancer, 2005,41(4): 555563.

[7]RAKESH K J, DAN G D, JEFFREY W C. Lessons from phase Ⅲ clinical trialsonantiVEGF therapy for cancer[J]. Nature, 2006,3(1):2440.

作者单位：1 青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003； 2 青岛市城阳区人民医院