Survivin和Caspase3在乳癌组织的表达及相关性

【摘要】  目的 了解Survivin和Caspase3在乳癌组织的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学方法检测56例乳癌组织和10例正常乳腺组织中Survivin和Caspase3表达，并分析其与临床病理特征相关性。结果正常乳腺组织中未见Survivin阳性表达，Caspase3阳性表达率为100%。乳癌组织中 Survivin和Caspase3阳性表达率分别为67.9%（38/56）、51.8%(29/56)，Survivin表达与淋巴结转移有关（χ2=7.09，P<0.01）,与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期均无关；Caspase3表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床TNM分期及淋巴结转移均无关。乳癌组织Survivin和Caspase3表达呈显著负相关（r=-0.361,P＜0.05）。结论 Survivin和Caspase3可通过促进或抑制细胞凋亡，对乳癌的发生和发展起重要作用。

【关键词】  乳癌；Survivin；Caspase3；免疫组织化学

THE EXPRESSIONS AND THEIR CORRELATION OF Survivin AND Caspase3 IN BREAST CANCER  LI MEILING, GAO MEIHUA, SONG YUNFENG, et al (Department of Immunology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the expressions of Survivin and Caspase3 and their relationship in breast cancer. Methods The expressions of Survivin and Caspase3 in 56 breastcancer patients and 10 normal breast samples were detected by immunohistochemical method, their association with clinical pathology was analyzed. Results In normal breast, no Survivin was expressed, and Caspase3 was 100% expressed; in cancer tissue, the positive expressions of Survivin and Caspase3 were 67.9% (38/56) and 51.8% (29/56), respectively. Survivin was related to lymph node metastasis (χ2=7.09,P<0.05), but not to age, tumor size,pathologic grade and clinical stage;  the expression of caspase3 had nothing to do with all above items as observed in Survivin. A negative correlation was revealed between Survivin and caspase3 in cancer tissue (r=-0.361,P<0.05). Conclusion Survivin and Caspase3 may play an important role in the occurrence and development of breast cancer through promoting or inhibiting apoptosis.

    ［KEY WORDS］ Breast neoplasms; Survivin; Caspase3; Immunohistochemistry

    细胞凋亡是机体的重要的生理过程，对维持组织的正常形态结构和机体内环境具有至关重要的作用，在肿瘤的发生、发展中主要起负调控作用，可以阻遏肿瘤细胞迅速增殖。蛋白酶Caspase家族在细胞凋亡中起核心作用，其中Caspase3与细胞凋亡关系最密切，参与多种因素诱导的细胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员，主要通过抑制活化状态的Caspase3、Caspase7，阻断细胞的凋亡过程。本研究应用免疫组化法检测乳癌组织Survivin和Caspase3的表达，分析其与临床病理因素的关系，探讨Survivin和Caspase3在乳癌发生发展中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  标本

    收集即墨市人民医院2008年1～6月手术切除乳癌标本56例，病人均为女性，年龄31～78岁，平均51.7岁，其中≤50岁者24例，＞50岁者32例。肿瘤的最大直径为1.5～9.5 cm,平均5.1 cm。按1997年国际抗癌联盟的TNM分期法分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期25例，Ⅲ期+Ⅳ期14例。组织学分级Ⅰ级17例，Ⅱ级23例，Ⅲ级16例。全部病例行根治手术，术前均未行放疗、化疗。另取10例正常乳腺组织作为对照组。

    1.2  试剂

    本文兔抗人Survivin多克隆抗体、Caspase3山羊抗人多克隆抗体、链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶（SP）免疫组化染色试剂盒、DAB试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

    1.3  实验方法

    组织标本经40 g/L中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片3张，片厚3 μm，一张行苏木精伊红染色，另两张分别行Survivin和Caspase3免疫组织化学染色。抗原修复采用微波法，实验步骤参照试剂盒说明书进行。一抗兔抗人Survivin多克隆抗体、Caspase3山羊抗人多克隆抗体工作浓度均为1∶50，用已知的免疫组化染色阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.4  结果判断

    Survivin阳性染色呈棕黄色颗粒状，主要定位于细胞浆内，少数在细胞核中；Caspase3阳性染色也呈棕黄色颗粒状，主要定位于细胞浆内。参照KOHLBERGER等[1]的IRS法计分。每张切片随机选取10个高倍镜视野（200倍），计数1 000个肿瘤细胞中Survivin、 Caspase3阳性表达细胞数并计分：阳性细胞数≤5％为0分，阳性细胞数6%～30％为1分，阳性细胞数31%～60%为2分，阳性细胞数＞60％为3分。阳性细胞染色强度计分：无染色者为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。以染色强度计分、阳性细胞数计分乘积判断结果：0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（＋），4～6分为阳性（），>6分为强阳性（），+～均为阳性。

    1.5  统计学处理

    用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，数据间比较采用χ2检验和四格表精确检验法，相关性采用Spearman相关分析。

    2  结    果

    2.1  乳癌组和对照组Survivin和Caspase3表达比较

    乳癌组Survivin的阳性表达率为67.9%（38/56），对照组为0,两者比较差异有显著意义（χ2=13.337，P<0.01）。乳癌组Caspase3阳性表达率为51.8%（29/56），对照组为100%（10/10）, 两者比较差异有显著性（χ2=6.287，P<0.01）。

    2.2  乳癌组织Survivin和Caspase3表达与临床病理因素的关系

    乳癌组织无淋巴结转移组Survivin的阳性表达率低于有淋巴结转移组，差异有显著意义（χ2=7.090，P＜0.01）；Survivin的表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级以及临床分期均无关（P＞0.05）。Caspase3的表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期以及淋巴结有无转移均无关（P＞0.05）。见表1。

    2.3  Survivin和Caspase3表达的相关性

    Survivin阴性表达组Caspase3阳性表达率为77.8%（15/18）, Survivin阳性表达组中Caspase3的阳性表达率为39.5%（15/38），两者比较差异有显著性（χ2=7.177,P＜0.01)。见表2。直线相关性分析显示，乳癌组织Survivin 与Caspase3表达呈负相关（r=-0.361,P<0.05）。表1  Survivin 和Caspase3表达与临床病理因素的关系临床病理表2  乳癌组织Survivin 与Caspase3表达的关系

    3  讨    论

    Survivin又名生存素，是IAP家族特殊的新成员，仅含有单一的杆状病毒IAP重复序列（BIR）功能区，无环指结构[2]。Survivin基因启动子序列中存在3个细胞周期依赖因子（CDE）和一个细胞周期同源性区域（CHR）,CDE、CHR和G1期抑制元件调节G2/M期基因表达的半衰期，使Survivin特异性地表达于有丝分裂的G2/M期[3]。Survivin基因过度表达可抑制细胞凋亡，有利于细胞的异常增殖和分化。Survivin作用机制可能是：①通过其BIR分子中的氨基酸残基Pro、Trp和Cys与Caspase3 和Caspase7结合抑制Caspase的活性，从而抑制细胞凋亡。由于Survivin在G2/M期的特异性表达，使得该期细胞可对抗异常因素诱导的凋亡,而Survivin在肿瘤细胞的过度表达，有利于细胞克服G2/M期的检查点(checkpoint)完成异常有丝分裂，而通过有丝分裂促进转化的肿瘤细胞异常增殖，导致肿瘤的形成[4];②与周期蛋白激酶Cdk4、p34cdc2相互作用阻断凋亡信号传导通路[5]。研究表明，Survivin蛋白主要分布于胚胎及分化未成熟的组织中，正常成人终末分化组织几乎不表达，在多种恶性肿瘤组织如乳癌、结肠癌等组织中Survivin呈异常高表达。TANAKA等[6]用免疫组化方法研究显示，Survivin在乳癌组织阳性表达率为70.7%，而在邻近正常组织中无表达。本研究Survivin在10例正常乳腺组织中不表达，在56例乳癌组织中阳性表达率为67.9%，两者相比较，差异有显著性，提示Survivin异常激活参与了乳癌的发生，Survivin与乳癌的发生发展有关。乳癌组织中Survivin的表达与病人年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期均无关，而在有淋巴结转移组Survivin阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，由此我们推测，有淋巴结转移的病人肿瘤细胞具有更强的侵袭性，在一定程度上提示Survivin高表达预示肿瘤预后不良，其机制与Survivin抑制肿瘤细胞的凋亡有关。

    Caspase家族是一组与线虫CED3同源的调控哺乳动物细胞凋亡的蛋白酶，即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族，目前共发现了14种。这些成员在氨基酸序列、空间结构及底物特异性上很相似，都有一个前域和一个酶的区域。而Caspase3则是此家族的重要功能执行者、细胞凋亡过程中的关键酶，Caspase3通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中。Caspase3活化主要有两条途径：一是经细胞表面膜受体如Fas、肿瘤坏死因子Ⅰ型受体相关蛋白（TNFR1）等活化；另一条途径是在死亡刺激因子作用下线粒体释放细胞色素C，活化的Caspase3通过裂解一系列底物而引起细胞凋亡。体外实验证实，Caspase3活化的两条途径都可被Survivin抑制[7]。Survivin可直接作用于Caspase3和 Caspase7，一方面可以与有活性的Caspase3和 Caspase7特异性结合，当Caspase3和Survivin结合后，即在细胞内失活；另一方面，Survivin也能阻止Caspase3和 Caspase7的自发激活[4]。本文的研究结果也显示，Caspase3在乳癌组织的低表达抑制了肿瘤细胞凋亡，促进了肿瘤细胞的生长，在乳癌的发生发展中可能起重要的作用；Caspase3的表达与病人年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期、有无淋巴结转移无关,与LU等[8]研究结果一致。提示Caspase3在乳癌中组织低表达抑制了肿瘤细胞的凋亡，促进了肿瘤细胞的生长。

    本文研究结果还显示，乳癌组织Survivin和Caspase3的表达呈显著负相关，推测Survivin可能通过直接抑制凋亡通路下游Caspase3和Caspase7的活性，阻止细胞凋亡[9]。在细胞周期的G2/M阶段，Survivin抑制凋亡并确保正常的细胞分裂，它在细胞周期的调节过程中高度表达，与Caspase3一起定位在中心体的微管上。在Survivin抑制阶段，Survivin和Caspase3、Caspase7均定位在微管上，从而防止Caspase3、Caspase7被激活而引起细胞凋亡。也可能Survivin作为上游调节子，通过阻断线粒体细胞色素C的释放，减少Caspase3和Caspase7的生成，从而间接抑制凋亡[10]。本实验结果还显示，有15例乳癌组织标本中Survivin和Caspase3同为阳性表达，推测Survivin可能通过非依赖Caspase3的途径来抑制细胞凋亡，如参与调节P53依赖的凋亡[11]。

    综上所述，乳癌的发生和发展是多基因共同作用的结果。Survivin和Caspase3共同参与乳腺细胞凋亡过程的调节，即Caspase3的低表达有助于乳癌的发生，Survivin 作为一种凋亡抑制蛋白在乳癌中能够减低Caspase3介导的细胞凋亡作用。但Survivin如何在肿瘤组织中被激活、Survivin抑制Caspase3的机制及Caspase3在肿瘤发生过程中的分子生物学机制，有待进一步研究。

【参考文献】
  [1]KOHLBERGER P D, BREITENECKER F, et al. Modified truecolor computerassisted image analysis versus subjective scoring of estrogen receptor expression in breast cancer: a comparison[J]. Anticancer Res, 1999,19(3B):21892193.

[2]苗卉,田秀珠. 凋亡抑制基因Survivin与肿瘤关系的研究进展[J]. 山西医科大学学报, 2006,37(1):103107.

[3]KOBAYASHI K, HATANO M D, OGASAWARA T, et al. Expression of amurine omlogue of the inhibitor of apoptosis protein is related toceproliferation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(4):14571462.

[4]李先平,高美华,石学香,等. CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因caspase3和survivin作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(3):192194.

[5]孙志清,项锋钢,王文华. 人脑星形细胞瘤组织Survivin与VEGF表达及意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(6):486491.

[6]TANAKA K, IWAMOTO S, GON G,（下转第382页）

作者单位：1 青岛大学医学院免疫学教研室,山东 青岛 266021； 2 即墨市人民医院心胸外科； 3 即墨市田横镇卫生院； 4 即墨市移风镇卫生院）