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【摘要】 目的 探讨切除修复交叉互补基因（ERCC1）在原发性上皮性卵巢癌顺铂化疗耐药中的意义。方法用组织芯片仪制备组织芯片并结合免疫组织化学技术，检测56例上皮性卵巢癌病人癌组织中ERCC1蛋白的表达情况，并以38例正常卵巢组织作为对照，分析其与顺铂化疗耐药的关系，同时分析ERCC1在原发性上皮性卵巢癌中的表达与临床手术病理分期（FIGO，2000）、病理学类型、分化程度、发病年龄、发生部位以及疾病发生的相关性。结果 38例正常卵巢组织中ERCC1阳性表达者17例（44.74%），56例上皮性卵巢癌组织ERCC1阳性表达者31例（55.36%），二者比较差异无显著性（χ2=1.022，P＞0.05）。上皮性卵巢癌中ERCC1的表达与临床手术病理分期、病理学类型、分化程度、发病年龄、发生部位及发病率均无明显的相关性（P>0.05）。上皮性卵巢癌顺铂化疗耐药组ERCC1的阳性表达率为76.67%，明显高于敏感组的30.77%，差异有显著性（χ2=11.87,P<0.05）。结论上皮性卵巢癌ERCC1表达与顺铂化疗耐药相关。
【关键词】 卵巢肿瘤；ERCC1蛋白；顺铂；抗药性；免疫组织化学
RELATIONSHIP BETWEEN THE EXPRESSION OF ERCC1 IN EPITHELIAL OVARIAN CARCINOMA AND CISPLATIN RESISTANCE TANG LIN, LIANG JUN, LI YUJUN (Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the significance of expression of ERCC1 gene in cisplatin resistance of chemotherapy for primary epithelial ovarian cancer (PEOC). Methods The expression of ERCC1 was analyzed retrospectively by tissue microarray (8×5) technology and immunohistochemistry in 56 patients with PEOC and in 38 controls with normal ovarian tissue. The association of the expression of ERCC1 in the cancer with cisplatin resistance, and with the clinical pathology of FIGO staging, type, cell differentiation, age, and location was analyzed. Results The positive expression of ERCC1 in 38 normal ovarian tissue was seen in 17 cases (44.74%); in 56 cancer patients, it was 31 cases (55.36%), no significant difference was noted (χ2=1.022,P>0.05). In PEOC, the expression of ERCC1 was not markedly correlated with FIGO staging, pathologic type, cell differdntiation, age, location and incidence (P>0.05).The positive ERCC1 expression rate in drugresistent group was 76.67%, much higher than 30.77% in drugsensitive group (χ2=11.87,P<0.05). Conclusion The expression of ERCC1 is related to cisplatin resistance in PEOC.
［KEY WORDS］ Ovarian neoplasms; ERCC1 protein; Cisplatin; Drug resistance; Immunohistochemistry
药物基因组学是基于药物反应的遗传多态性提出来的，这些多态性的存在可能导致药物治疗中药效和不良反应的个体差异。卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为20%～30%。治疗的难点为卵巢癌细胞对化疗药物，尤其是对一线化疗药顺铂产生耐药性，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应。顺铂通过形成铂DNA加合物导致细胞DNA损伤而产生细胞毒作用[2]，这种DNA损伤主要通过核苷酸切除进行修复，切除修复交叉互补基因（ERCC1）在其中起着关键作用，其表达升高与卵巢癌等多种肿瘤耐药相关[3]。本实验采用药物基因组学的方法，用组织芯片仪Becher制备40（8×5）点阵组织芯片，结合免疫组织化学技术检测ERCC1在正常卵巢组织以及顺铂化疗敏感和耐药的上皮性卵巢癌病人肿瘤组织表达，从分子水平上了解卵巢癌细胞ERCC1表达与顺铂化疗耐药的相关性, 揭示ERCC1与上皮性卵巢癌发病的关系，以指导临床卵巢癌病人的治疗。
1 资料和方法
1.1 一般资料
2000年1月～2007年1月,青岛大学医学院附属医院妇科收治、临床及随访资料完整的原发性上皮性卵巢癌病人56例，均经病理确诊。病人年龄为20～72岁，中位年龄51岁。按照2000年FIGO手术病理分期标准：Ⅰ期 7例，Ⅱ期 10例，Ⅲ期 36例，Ⅳ期 3例；组织学分类：浆液性囊腺癌37例，黏液性囊腺癌8例，透明细胞癌6例，子宫内膜样癌5例；组织学分级：高分化8例，中分化10例，低分化38例；肿瘤发生于单侧卵巢者27例，双侧者29例。所有组织标本取得后均用甲醛固定，石蜡包埋保存。另取正常卵巢组织38例作为对照。
1.2 治疗方法
早期（FIGO Ⅰ～Ⅱ期）上皮性卵巢癌病人行全面确定分期手术，全子宫和双附件切除（卵巢动静脉高位结扎），盆腔及腹主动脉旁淋巴结清除，大网膜和阑尾切除。晚期（Ⅲ～Ⅳ期）病人行最大限度的肿瘤细胞减灭术。56例上皮性卵巢癌病人术前均未接受放化疗及免疫治疗，术后均行以顺铂为主方案化疗6～9个疗程。
1.3 化疗疗效评价标准
结合化疗疗效评价标准[5]及诊治规范[6]，将上皮性卵巢癌病人分为化疗耐药组和化疗敏感组。
1.4 ERCC1检测方法
应用组织芯片仪Becher制备40（8×5）点阵组织芯片，采用免疫组织化学PV 9000二步法检测ERCC1表达，检测试剂盒购自北京中杉金桥公司。ERCC1鼠抗人单克隆抗体为美国Neomarker生物公司生产，抗体1∶120稀释。新鲜DAB显色，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.5 免疫组化结果观察
免疫组化结果由两位资深病理学专家使用半定量评分系统独立判定。分别于100、200及400倍光镜下观察切片，ERCC1阳性染色定位于细胞核，镜下组织细胞结构清晰，细胞核有棕黄色颗粒沉着，且染色明显高于背景为阳性表达细胞。参考文献[7]标准，高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例，用组织学评分(∑Pi)计算积分。其中i代表细胞染色深浅， 0：不显色或显色不清；1：浅黄色；2：棕黄色；3：深褐色。P代表将阳性细胞的百分率数值：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。积分0～3分为弱阳性(+)，4～8分为中度阳性()，9～12分为强阳性()。及以上为阳性表达。
1.6 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，数据间比较采用χ2检验、Fishers精确检验及独立样本t检验。
2 结 果
2.1 上皮性卵巢癌组织中ERCC1的表达及其与临床病理特征的关系
ERCC1阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒状。38例正常卵巢组织中ERCC1阳性表达者17例（44.74%），56例上皮性卵巢癌组织ERCC1阳性表达者31例（55.36%），二者比较差异无显著性（χ2=1.022，P＞0.05）。ERCC1表达与上皮性卵巢癌病人年龄、手术分期、组织学类型、组织学分级、发生部位等临床病理特征及发病率均无明显的相关性（P＞0.05）。见表1。表1 上皮性卵巢癌组织ERCC1表达与临床病理特征的关系临床病理特征nERCC1阳性
2.2 上皮性卵巢癌组织ERCC1表达与顺铂化疗耐药的关系
56例上皮性卵巢癌组织中化疗耐药者30例，其中ERCC1阳性表达23例（76.67%）；化疗敏感者26例，ERCC1阳性表达者为8例（30.77%），化疗耐药组ERCC1阳性表达率明显高于敏感组，差异有显著性（χ2=11.87,P<0.05）。耐药组积分值为5.17±3.38，敏感组积分值为2.38±2.26，化疗耐药组积分值明显高于敏感组，差异有统计学意义（t=3.656，P<0.05）。
3 讨 论
核苷酸切除修复(NER)是DNA最主要的修复机制，其修复功能异常在多种肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。ERCC1在NER系统中起着损伤识别和核酸内切酶的双重功能，其表达水平可以代表NER系统的活性。ERCC1基因是利用对紫外线敏感的中国仓鼠细胞(CHO)和人类瘤细胞株进行细胞融合和互补试验而克隆出的一种与紫外线敏感的突变型鼠细胞互补的人类修复基因，定位于染色体19q13.2，有4种不同相对分子质量的mRNA，但只有111 kb的mRNA表达出相对分子质量为33 000～36 000的蛋白时，才表现其功能。根据TED等[7]的报道，ERCC1基因属于肿瘤抑制基因中的看家（caretakers）基因的一种，它的高表达往往与铂类制剂耐药相关。
单核苷酸多态性（SNPs）主要是指在基因组水平上由单个碱基的变异所引起的DNA序列多态性。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500～1 000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个，甚至更多。SNPs碱基的变异是由单个碱基的转换或颠换所引起。ERCC1的SNPs解释了不同的人其DNA修复能力不同，因此导致不同病人对放化疗敏感性不同。
关于卵巢癌铂类耐药与ERCC1相关性的研究较多。KEN等[7]研究显示，ERCCl蛋白水平未检出的志愿者当使用基于铂类的化疗药物(如顺铂)时，其5年生存率可达到47%；手术切除肿瘤后未治疗者的生存率为39%；当肿瘤的ERCC1蛋白含量丰富时，结果正好相反，那些未接受任何化疗的病人治疗结果要好于经治者；未治疗的病人的生存率为46%，而经顺铂治疗的病人为40%。DABHOLKAR等[8]的研究表明，接受过顺铂化疗的晚期卵巢癌病人组织中ERCC1、XPB、XPA、CSB表达均增高，而仅ERCC1 mRNA表达与顺铂化疗效果之间存在显著相关性。本文检测了56例卵巢上皮性癌组织中 ERCC1的表达，结果显示，ERCC1表达水平与卵巢上皮性癌病人年龄、手术分期、组织学类型、组织学分级、发生部位等临床病理类型以及上皮性卵巢癌的发病无关，而与卵巢上皮性癌病人以顺铂为基础联合化疗的耐药性有关。其中化疗耐药组 ERCC1基因的阳性表达率为76.67％，显著高于化疗敏感组 30.77％。比较两组综合染色强度和阳性细胞比例的积分值，结果显示，耐药组亦明显高于敏感组。证实ERCC1表达升高引起的 DNA损伤修复能力增强与顺铂化疗耐药相关。化疗造成卵巢癌细胞的DNA受损，而ENR基因 ERCC1能增强肿瘤细胞对受损 DNA的修复，从而导致细胞对顺铂的耐受。ERCC1可能成为卵巢癌潜在的基因治疗靶点。
ERCC1表达呈增高趋势的病人应该避免使用以顺铂为基础的化疗方案。然而，目前尚没有针对ERCC1高表达的铂类替代化疗药物。GUICHARD等[9]研究结果显示，ERCC1的拮抗剂伊立替康能减慢早期铂DNA造成的DNA损伤，此时ERCC1 mRNA表达也下调70%；吉西他滨与顺铂有协同抗肿瘤作用，近来发现能其下调ERCC1表达[10]。另外，RNA干扰技术是一种能够高效抑制靶基因表达方法，国内外研究表明通过RNA干扰ERCC1基因表达，能增强顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用，为克服卵巢癌化疗耐药提供了一条新途径。
【参考文献】
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[8]DABHOLKAR M, THORNTON K, VIONNET L, et al. Increased mRNA levels of xeroderma pigmentosum completmentation group B(XPB)and Cockayne’s syndrome complementation group B(CSB)without increased mRNA levels of multidrugresistance gene(MDR1)or metallothioneinⅡ(MTⅡ) in platinumresistant human ovarian cancer tissues[J]. Biochem Pharmacol, 2000,60(11):16111619.
[9]GUICHARD S, ARNOULD S, HENNEBELLE I, et al. Combination ofoxaliplatin and irinotecan on human colon cancer cell lines: activity in vitroandin vivo[J]. Anticancer Drugs, 2001,12(9):741751.
[10]ROSE P G. Gemcitabine reverses platinum resistance in platinum resistant ovarian and peritoneal carcinoma[J]. Int J Gynecol Cancer, 2005,15(11):1822.
作者单位：青岛大学医学院附属医院妇科,山东 青岛 266003