CD44v6和P16表达与非小细胞肺癌生物学行为关系

【摘要】  目的 探讨非小细胞肺癌组织细胞黏附分子CD44v6和新型抑癌基因p16的表达及其与肿瘤生物学行为的关系。方法 应用免疫组织化学方法对72例非小细胞肺癌组织进行CD44v6和P16蛋白检测。结果CD44v6阳性染色定位于肺癌细胞的细胞质，阳性表达率为68.05%，其表达强度与非小细胞肺癌的组织学分级、淋巴结转移及临床分期显著相关（χ2=9.90～16.86，P均＜0.01），鳞癌的CD44v6的表达率与腺癌比较差异有显著性（χ2=7.27, P＜0.05）。P16阳性染色定位于肺癌细胞的细胞核，阳性表达率为41.67%，其表达强度与非小细胞肺癌的组织学分级、临床分期、淋巴结转移及原发癌大小相关（χ2=11.53～17.82，P均＜0.05），与病理类型无关（χ2=3.40，P＞0.05）。CD44v6和P16的表达强度与病人的年龄、性别均无关（P均＞0.05）。非小细胞肺癌组织中CD44v6和P16的表达强度呈显著负相关(r=-0.42，P＜0.01）。结论 CD44v6和P16在非小细胞肺癌的发生发展过程中有一定的作用，联合检测CD44v6和P16可作为判定非小细胞肺癌恶性程度及评估其侵袭性、转移性的重要方法。

【关键词】  蛋白质CD44v6；蛋白质P16；癌,非小细胞肺；免疫组织化学

CORRELATION OF EXPRESSIONS OF CD44v6 AND P16 WITH BIOLOGICAL BEHAVIOR OF NONSMALLCELL LUNG CANCER ZHANG HANHAN, ZHU BO, KONG LIJUN (Department of Biochemistry, Binzhou Medical College, Yantai 264003, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the relationship of the expressions of adhesion molecule CD44v6 and a newtype antioncogene P16 with biological behavior of nonsmallcell lung cancer (NSCLC). Methods Immunohistochemical method was used to detect the expressions of CD44v6 and P16 in 72 cases of NSCLC.  Results Positive staining of CD44v6 was found in cytoplasm, with its positive rate being 68.05%. The expression intensity of CD44v6 was correlated with histologic grading, clinical staging and lymph node metastasis of NSCLC (χ2 =9.90－16.86,P＜0.01). The difference of expressions of CD44v6 between squamous carcinoma (SC) and adenocarcinoma (AC) was significant (χ2=7.27,P＜0.05). The positive P16 was found in nuclei, with the positive rate being 41.67%, its intensity of expression was correlated with histologic grading, clinical staging, lymph node metastasis and the size of the primary NSCLC (χ2=11.53－17.82,P＜0.05), but not with the type of pathology (χ2=3.40,P＞0.05). The expression intensity of CD44v6 and P16 were not related to age and gender (P＞0.05). The expression of CD44v6 was negatively correlated with that of P16 in NSCLC (r=-0.42,P＜0.01). Conclusion CD44v6 and P16 play a certain role in the pathogenesis of NSCLC. Combined detection of CD44v6 and P16 may serve as an important parameter to evaluate the malignancy, invasion and metastasis of this malignancy.

    ［KEY WORDS］ Protein CD44v6; Protein P16; Carcinoma, nonsmallcell lung; Immunohistochemistry

    肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，其死亡率已占癌症死亡率之首。故明确其发生、发展及转移机制，对有效地防治该肿瘤非常重要。肺癌的形成是一个多阶段、多步骤的复杂过程[1]。CD44v6 是一种细胞黏附分子， 其过量表达与多种人体恶性肿瘤发生、发展、侵袭和转移密切相关[2，3]。p16 基因是一种新型抑癌基因，其编码产物为P16蛋白。研究发现，p16 基因与肿瘤转移抑制相关[4,5]。本研究应用免疫组织化学方法对组织学分级、临床分期、淋巴结转移等程度不同的72例非小细胞肺癌（NSCLS）组织进行CD44v6 和p16的联合检测,旨在探讨其在NSCLC发生与发展过程中的作用。现将结果报告如下。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    随机取自滨州医学院附属医院2005～2007年间手术切除并经病理检查证实的NSCLC标本72例（所有病例术前均未行任何治疗）。72例病人中，男59例，女13例；年龄35～72岁。鳞癌32例（Ⅰ级5例、Ⅱ级15例、Ⅲ级12例），腺癌40例（Ⅰ级10例、Ⅱ级12例、Ⅲ级18例）。肿瘤直径≤5 cm者50例， ＞5 cm者22例。有转移者40例，无转移者32例。按1997年肺癌国际分期修正系统进行临床分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期19例，Ⅲ期24例。所有标本均经40 g/L的中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

    1.2  主要试剂

    鼠抗人CD44v6、p16单克隆抗体为丹麦Dako 公司产品，SP免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

    1.3  检测指标及其方法

    CD44v6及P16的表达采用免疫组织化SP法检测。切片经常规二甲苯脱蜡梯度乙醇水化。一抗孵育前切片经0.01 mol/L的柠檬酸型缓冲液(pH 6.0) 煮沸抗原修复。操作步骤按产品说明书进行。DAB显色，镜下观察，自来水终止显色。实验采用已知CD44v6和P16阳性胃癌组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.4  结果判定

    以细胞胞质呈棕黄色颗粒状着色为CD44v6表达阳性；以细胞核呈棕黄色颗粒状着色为P16表达阳性，无着色者为阴性。按染色强度记分：无染色为0分，棕黄色为1分，深棕黄或棕褐色为2分。按阳性细胞百分比记分：≤5％为0分，6%～30％为1分；31%～70％为2分；≥71％为3分。以上述两种记分方式相加所得的总分进行结果判断，总分0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～5分为强阳性。

    1.5  统计学分析

    所有数据均应用SPSS for Windows 13.0及PPMS 1.5[6]统计软件统计分析。统计处理采用χ2检验和相关分析。

    2  结    果

    2.1  CD44v6表达与NSCLC病人临床病理特征间的关系

    CD44v6阳性产物呈棕黄色或棕褐色颗粒状,定位于细胞质。在72例NSCLC中，23例阴性，34例弱阳性，15例强阳性，其阳性表达率为68.05%； CD44v6的表达强度与NSCLC的组织学分级、淋巴结转移及临床分期均显著相关（χ2=9.90～16.86,P均＜0.01），鳞癌的CD44v6的表达率与腺癌比较差异有显著性（χ2=7.27,P<0.05），CD44v6的表达与病人的年龄、性别及原发瘤大小均无关（P＞0.05）。见表1。

    2.2  P16表达与NSCLC病人临床病理特征间的关系

    P16 阳性产物呈棕黄色或棕褐色颗粒状，定位于细胞核。在72例NSCLC中，42例阴性，16例弱阳性，14例强阳性，阳性表达率为41.67%。不同组织学分级、不同临床分期的NSCLS组织中P16的表达强度差异有显著意义（χ2=17.82、14.92,P<0.05）；P16的低表达与NSCLC易发生淋巴结转移有关，淋巴结有转移组P16的表达强度显著低于淋巴结无转移组（χ2=13.63,P<0.01）；在原发瘤＞5 cm的病人组中的表达强度显著低于≤5 cm病人组(χ2=11.53,P＜0.01），P16表达与病人年龄、性别及组织病理学类型均无关。见表1。

    2.4  CD44v6与P16在NSCLC中表达的相关性

    在CD44v6 表达阳性的49 例中,P16阳性表达13例(26.5 %),CD44v6表达阴性的23 例中,P16 表达阳性17例(73.9 %)。CD44v6 表达与P16 表达呈负相关(r=-0.42，P＜0.01）。表1  CD44v6和P16在NSCLC中的表达及其与病人临床病理特征间的关系

    3  讨    论

    肺癌是常见的恶性肿瘤之一，如今，由肺癌及其转移瘤所致的死亡率已占癌症死亡率之首。根据最新报告显示,肺癌、乳癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。肺癌的发生与发展是多因素共同作用的结果，这些因素中既包括癌基因的激活、抑癌基因的失活，也包括黏附分子的作用。CD44 是一种近年来备受关注的介导细胞与细胞、细胞与基质间相互作用的细胞表面黏附分子，主要参与异质性黏附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的黏附，异质性黏附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。因此,CD44 能直接参与肿瘤的浸润和转移。CD44v6 是CD44 的一种拼接变异体,其表达可改变肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能,有助于肿瘤细胞获得转移潜能。其促进肿瘤细胞转移的机制可能是表达CD44v6 的肿瘤细胞与远隔的淋巴管和血管内某一配体结合,使转移至那里的肿瘤细胞更加稳定地寄宿与生长,有效形成转移瘤。研究表明，CD44v6高表达与消化道肿瘤(胃癌、结肠癌、肝癌)及乳癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤等肿瘤转移密切相关。

    p16基因是定位于人类第9号染色体短臂的一种抑癌基因，其编码的蛋白产物为细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制因子。P16蛋白参与细胞周期的调控，它能竞争性抑制细胞周期蛋白D1与CDK4结合，使抑癌基因Rb的表达产物处于非磷酸化的活性状态，从而阻止细胞由G1期进入S期，故具有抑制肿瘤生长的作用。研究显示，p16 基因突变和缺失广泛存在于多种肿瘤中,如胃癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤中都检测到p16 基因的高频率突变及缺失, 提示p16基因变异是肿瘤发生与发展过程中的一个重要事件[7]。

    本实验研究结果显示，CD44v6在NSCLC组织中的阳性表达率为68.05 %，而且CD44v6表达程度与NSCLC的组织学分级和临床分期有关(P<0.01)，与淋巴结转移也密切相关(P<0.01)，鳞癌的CD44v6的表达率高于腺癌，这与大多数学者报道的结果一致,这些结果提示CD44v6在NSCLC的发生、发展及淋巴结转移的过程中起着重要作用，CD44v6的高表达促进了NSCLC的发生、发展及浸润。本文结果显示，P16在NSCLC组织中的阳性表达率为41.67 %，P16的低表达与NSCLS的组织学分级显著相关（P＜0.01），NSCLC伴淋巴结转移组P16表达明显低于无淋巴结转移组（P＜0.01），在原发瘤＞5 cm病人组中的表达强度显著低于≤5 cm病人组(P＜0.01）。这些均提示P16低表达与NSCLC的发生、发展及转移有关。以上所有结果提示，CD44v6和P16的表达在NSCLC转移和临床进展过程中起着重要作用,联合检测CD44v6和P16可作为判断肿瘤恶性程度、评估其侵袭性与转移性及判断预后的客观指标。

    另外，本研究还显示，在NSCLC中CD44v6 表达与P16 表达呈负相关,这可能是许多学者提出的基因协同作用假说的印证。即在NSCLC的发生、发展及转移过程中CD44v6 和P16在各自独立的方面分别发挥着作用，但同时两者之间又有着某种负性协同关系。但关于其具体作用机制，将有待进一步探讨。

【参考文献】
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[3]谷化平,尚培中. CD44v6和PTEN表达与结直肠癌浸润和转移关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1):35.

[4]NAKAMURA T, TDE H, EGUCHI R, et al. Concomitant analysis of P16/INK4, cyclin D1, and retinoblastoma protein exprssion in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Hepatogast roenterology, 2003,50(53):13211326.

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[6]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

[7]GERADT S J, INGRAM C D. Abnormal expression of cell cycle regulatory proteins in ductal and lobular carcinomas of the breast[J]. Mod Pat Hol, 2000,13:945953.

作者单位：1 滨州医学院生物化学教研室，山东 烟台 264003； 2 滨州医学院药学院