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【摘要】 目的 研究CEA免疫组化染色在检测肿瘤系膜微转移及环周切缘(CRM)侵犯方面的价值。方法选取经纤维结肠镜及病理证实为直肠癌病人40例，应用大组织切片技术对术后标本处理，分别行常规染色及CEA免疫组化染色，比较分析两种染色方法在检测肿瘤系膜微转移及CRM侵犯方面的价值。结果 CEA染色检测肿瘤浸润程度大于常规病理染色，差异有显著性（t=5.23，P<0.001）；常规病理染色CRM阳性6例，CEA免疫组化染色CRM阳性10例，两种染色方法在诊断CRM阳性率方面差异有显著性（χ2=29.60，P<0.001）；两种染色方法在检测系膜微转移方面的差异与血浆CEA水平、肿瘤分化程度有关（χ2=7.40、7.72，P＜0.05），与性别、肿瘤部位、淋巴结分期无明显相关性（P＞0.05）。结论 CEA免疫组化染色有助于发现直肠癌CRM侵犯及在直肠系膜中的微转移情况，直肠癌系膜内微转移与肿瘤分化程度和血浆CEA水平有关。
【关键词】 直肠肿瘤；肠系膜；肿瘤转移；免疫组织化学
THE VALUE OF CEA IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING IN DETECTION OF MESENTERIUM MICROMETASTASIS AND CUTTINGEDGE INVASION IN RECTAL CANCER ZHOU JIAN, ZHOU YANBING, ZHUO HONGQING, et al (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To assess the CEA immunohistochemical staining for detecting micrometastasis in mesenterium and cuttingedge invasion in rectal cancer. Methods Fourty patients with rectal cancer confirmed by colonofiberscopy and pathology were enrolled. The specimens were treated with bigslice technique. HE and CEA staining were applied to detect the micrometastasis and invasion of the tissue. Results The mesorectal invasion detected by CEA staining was deeper than the HE staining (t=5.23,P<0.001). Cuttingedge invasion was observed in six cases by conventional staining and 10 cases by CEA technique. The difference between the two staining methods was significantly correlated (χ2=29.60,P<0.001), the difference between them in terms of micrometastasis was related to plasma CEA and differentiation of the tumor (χ2=7.40,7.72;P<0.05), but not related with sex, tumor location, and lymphnode staging (P＞0.05). Conclusion CEA staining is conduce to the detection of micrometastasis and cuttingedge invasion in rectal cancer patients. The mesorectal micrometastasis is associated with tissue differentiation and plasma CEA.
［KEY WORDS］ Rectal neoplasms; Mesentery; Tumor metastasis; Immunohistochemistry
自HEALD提出全直肠系膜切除术(TME)手术方式后，中低位直肠癌治疗效果明显提高，病人术后5年生存率可达到65%，局部复发率为9%[1，2]。业已证明中低位直肠癌局部复发与肿瘤系膜浸润、环周切缘(CRM)阳性、直肠系膜残留等因素有关，在诸多局部复发相关因素中，CRM越来越受到人们的重视。CRM阳性病例术后局部复发率为15%～85%，但CRM阴性病例仍有3%～10%复发率[3]。推测与传统病理检查难以发现的病灶残留有关，即肿瘤微转移，究竟肿瘤在直肠系膜是否存在微转移及其可能发挥的作用仍然存在争议。本研究应用CEA免疫组化染色方法和常规病理检查，观察比较直肠癌系膜微转移、CRM阳性率情况，分析可能的临床病理因素。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
2007年10月～2008年9月，选取我院普外科经纤维结肠镜及病理证实为中低位直肠癌病人手术切除标本40例，其中男26例，女14例；年龄50～79岁，中位年龄67岁。所行手术均为直肠癌根治术，按照TME手术原则，直视下锐性分离直肠系膜，其中LAR手术36例，Mile手术4例，肿瘤距远端切缘距离均超过2 cm，术后切除标本TME评分[4]3分。肿瘤位于前壁3例，后壁24例，侧壁13例；按直肠癌TNM分期（AJCC肿瘤分期第6版）标准，其中T2期12例，T3期28例； N0者25例，N1者9例，N2者6例；病理学类型：低分化腺癌8例，中分化腺癌29例，高分化腺癌3例。血浆CEA水平：术前血浆CEA水平<3.4 μg/L者13例，血浆CEA水平≥3.4 μg/L者27例。
1.2 大切片标本制作
所有切除标本自肠系膜下动脉注入40 g/L的甲醛溶液，然后将其置入40 g/L的甲醛溶液中浸泡48～72 h。自远端起每隔1 cm厚度进行横切面取材，取材范围为环形直肠肠壁全层，完整直肠系膜。将横向切取厚度为0.5 cm直肠肠壁组织环做成大切片标本[5～7]，沿肿瘤在直肠系膜内浸润最深部位纵向切取组织条一块，厚度约1 mm，行连续切片。
1.3 免疫组化染色方法
将组织切片分别行苏木精伊红(HE)及CEA染色。CEA染色采用Zymed公司的PicTure二步法免疫组化检测试剂。组织切片脱蜡、水化→高压锅热修复→PBS冲洗→滴加一抗，37 ℃孵育2 h→PBS冲洗→应用DAB溶液显色→蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。
1.4 阅片方法
由两位病理学医师在显微镜下观察肿瘤在系膜内浸润深度，判断肿瘤浸润的层次，并确定肿瘤浸润最深部位，对肿瘤侵犯外缘进行标记，应用螺旋测微器测量所标记点与CRM之间的距离并读数，读数精确至0.02 mm。测量肿瘤外缘距周边切缘（盆筋膜脏层）的距离（D），以D≤1 mm定义为CRM阳性[8]。
1.5 数据统计分析
所有数据应用SPSS 12.0及PPMS 1.5[9]统计软件处理，HE染色及CEA染色之间肿瘤浸润程度差异应用配对t检验，而对于CRM阳性及CEA染色系膜微转移阳性率的相关影响因素分析应用χ2检验及Fisher精确检验法。
2 结 果
2.1 CEA免疫组化染色阳性情况
CEA免疫组化染色肿瘤系膜浸润深度的可信区间为（2. 3±0.4）cm，HE染色可信区间为（2.7±0.5）cm。两种染色方法检测系膜浸润深度的差异有显著性（t=5.23，P<0.001）。本组CEA免疫组化染色共检出在系膜内微转移病例27例，系膜微转移阳性率为67.5%； HE染色CRM阳性6例，阳性率为15.0%；CEA免疫组化染色CRM阳性10例，阳性率为25.0%；两种染色方法在CRM阳性率方面比较，差异有显著性（χ2=29.60，P<0.001）。
2.2 CEA免疫组化染色阳性相关因素分析
血浆CEA水平<3.4 μg/L病例CEA免疫组化染色阳性率38.5%（5/13），而血浆CEA水平≥3.4 μg/L阳性率为81.5%（22/27）,两者之间比较差异有显著意义（χ2=7.40，P＜0.05）；高分化腺癌阳性率为0（0/3），中分化腺癌为69%（20/29），低分化腺癌为87.5%（7/8）,差异有显著性（χ2=7.72，P<0.05）；CEA免疫组化染色系膜微转移阳性率与病人性别、肿瘤部位、淋巴结分期无明显相关性（P>0.05）。表1。表1 直肠系膜微转移相关临床病理因素分析临床病理因素nCEA免疫组化染色阳性例数 注：*应用Fisher精确检验法。
3 讨 论
CEA免疫组化染色结合大组织切片技术，可以直接用肉眼观察或显微镜监测包括肿瘤原发灶、直肠壁和直肠系膜标本全貌。应用CEA 免疫组化技术研究直肠癌在系膜浸润还未见报道。本研究应用CEA免疫组化染色对直肠癌标本进行术后病理评价，并研究CEA免疫组化染色在直肠系膜肿瘤微转移监测方面的意义。
本研究结果显示，CEA免疫组化染色检测出直肠肿瘤在直肠系膜内的微转移率达到67.5%，并且两种不同染色方法，直肠肿瘤在系膜内的浸润深度之间有统计学差异。CEA免疫组化染色与常规病理染色相对比，其直肠系膜微转移灶检出率及肿瘤细胞浸润深度比较均有明显统计学差异，提示CEA免疫组化染色能够发现常规病理染色所未发现的肿瘤细胞浸润微转移。并且也表明CEA免疫组化对于直肠癌细胞敏感度较常规病理染色高。CEA免疫组化提示的肿瘤细胞在直肠系膜内的高转移率，表明直肠癌病人术后直肠系膜内存在常规病理所不能发现的微转移灶，进一步证明了低位直肠癌手术施行全直肠系膜切除、保持标本环周完整性的重要性。但直肠癌病人的系膜内微转移与生存率及局部复发率的关系，仍需要进一步临床随访研究来证实。
GOSENS等[8]的研究显示，T3、T4期直肠癌病例CRM阳性率分别为17%、25%，CRM阳性病例局部复发率为43%，而阴性病例局部复发率为8%，生存率则分别为58%和80%。CRM浸润是直肠癌局部复发和影响生存率的重要因素。本研究HE染色肿瘤CRM阳性率为15%，CEA免疫组化染色CRM阳性率为25%，两种染色方法在CRM阳性率检测方面差异有显著性。这也表明在常规病理染色显示CRM为阴性的病例，在系膜内仍有可能有直肠肿瘤细胞的残余，从而可能导致直肠癌CRM阴性病人术后局部复发。因此，CEA免疫组化染色较常规病理染色更有助于发现直肠肿瘤细胞在系膜内的残留及微转移灶。
本研究结果显示，血浆CEA水平处于正常范围和高于正常范围其CEA免疫组化染色阳性率分别为38.5%、81.5%，两者之间差异有显著性，表明血浆CEA水平高于正常值的直肠癌病例，其CEA免疫组化阳性率高于血浆CEA正常病例，CEA免疫组化染色对于血浆CEA水平增高病例敏感度更高。这种情况考虑与肿瘤的浸润、侵袭能力有关，高侵袭能力的肿瘤细胞，组织表达CEA能力较高，而且CEA表达水平与微转移相关，与文献报道基本一致[8]。
TOCCHI等[11]研究也表明，淋巴结浸润是盆腔局部复发的重要因素。本研究显示，N0、N1、N2淋巴结分期病人标本CEA免疫组化染色阳性率差异有显著性，表明淋巴结侵犯与肿瘤细胞在直肠系膜内的浸润与微转移灶相关，也提示淋巴结侵犯是直肠癌的不良预后信息，但淋巴结浸润及淋巴结微转移在直肠癌病人术后局部复发及预后方面的作用还有待进一步研究。CEA免疫组化染色阳性率与病人性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度无明显相关性。
总之，本研究结果显示，CEA免疫组化染色可以作为直肠癌病人术后常规病理染色一个重要补充，结合大组织切片技术，能够对直肠癌术后标本进行全面、详细观察，能够发现直肠癌细胞在系膜内常规病理所不能发现肿瘤微转移灶。但是CEA免疫组化染色检测肿瘤在直肠系膜的微转移与直肠癌病人预后及局部复发的关系，仍需进一步研究观察。
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作者单位：青岛大学医学院附属医院普外科，山东 青岛 266003