荷叶黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】  目的 观察荷叶黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法 将4月龄雄性Wistar大鼠50只，随机分为对照组(10只)、模型组(20只)和治疗组(20只)。建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,模型组和治疗组大鼠于冠状动脉结扎和再灌注前1 min分别由左心腔缓慢注射生理盐水、荷叶黄酮(60 mg/kg)。2 h后处死动物，应用苏木精伊红染色观察组织形态学的改变，应用免疫组织化学方法测定心肌组织中Bax蛋白、Bcl2蛋白及Caspase3的表达。结果 治疗组细胞水肿较模型组明显减轻。与模型组比较，治疗组Bax及Caspase3蛋白的表达均明显降低，而Bcl2蛋白的表达明显升高(F=3.33～4.17,q=3.34～8.03,P<0.05)。结论 荷叶黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与上调Bcl2、下调Bax和Caspase3的表达，减少细胞凋亡有关。

【关键词】  心肌;再灌注损伤;荷叶黄酮;bcl2相关X蛋白质;基因,bcl2;Caspase3

PROTECTIVE EFFECT OF NELUMBO FLAVONE ON MYOCARDIUM ISCHEMIAREPERFUSION INJURY IN RAT JI BING, SONG TAO, XU CHENGWEI, et al (Department of Anatomy, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); Objective To investigate the protective effect of Nelumbo Flavone on myocardium ischemiareperfusion injury in rat and probe into the mechanism of protection. Methods Fifty 4monthold male SD rats were randomly divided into three groups: control group (10 rats), model group (20 rats), and treatment group (20 rats). A rat model of myocardium ischemiareperfusion injury was established. Rats in the model and treatment groups received intraventricular injection of normal saline and Nelumbo Flavone (60 mg/kg), respectively, one minute before coronary artery ligation and reperfusion. The animals were sacrificed two hours later. Eosinhematoxylin (HE) staining was performed for morphology observation and immunohistochemistry staining was used to study the expressions of Bax, Bcl2 and Caspase3 proteins in myocardium. Results Compared with the model group, there was less myocardium edema in the treatment group. The expressions of Bax and Caspase3 proteins were significantly lower and the expression of Bcl2 was significantly higher in the treatment group (F=3.33-4.17;q=3.34-8.03;P<0.05). Conclusion Nelumbo Flavone shows protective effects on rat myocardium ischemiareperfusion injury. The mechanism of protection might be related with upregulation of Bcl2, downregulation of Bax, inhibition of Caspase3 and reduction of cell apoptosis.

　　[KEY WORDS] Myocardial; Reperfusion injury; Nelumbo flavone; bcl2associated X protein; Gene, bcl2; Caspase3

　　心血管疾病在许多国家成为第一致死原因, 而冠心病是其中最主要的一种心脏病。目前冠心病的治疗方法有:药物治疗(经典治疗)、冠状动脉旁路移植术和经皮冠状动脉腔内成形术。无论哪种治疗措施均可对心脏造成一定的缺血再灌注损伤。而大量的基础和临床研究证实,心肌缺血再灌注后,可以出现再灌注心律失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常以及心肌超微结构的改变。因此,对于减轻心肌缺血再灌注损伤的研究倍受重视。本文通过建立心肌缺血再灌注损伤的动物模型，探讨荷叶黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤(IRI)的作用及其机制。

　　1 资料和方法

　　1.1 实验动物分组

　　健康4月龄雄性Wistar大鼠50只,体质量(180±25)g,清洁级，由青岛市药检所动物中心提供。将大鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(20只，给予生理盐水)和治疗组(20只，给予荷叶黄酮60 mg/kg)。

　　1.2 荷叶黄酮的提取

　　荷叶烘干粉碎、脱脂、体积分数0.95乙醇提取、过滤、浓缩得黄酮粗提液，再经AB8树脂柱水洗脱、体积分数0.70乙醇洗脱、收集饱和峰组分，浓缩、冷冻干燥得精制黄酮(以芦丁为标准品，紫外线分光光度法测定，其纯度为58%)[1]。

　　1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型制备[2]

　　模型组和治疗组大鼠在1.55 mol/L乌拉坦5 mg/g 静脉麻醉后,仰位固定,标准Ⅱ导联心电图检测,连接气管插管待开胸后连接人工呼吸机(潮气量为2.0 L/100 mg,频率50 min-1)。在胸骨左缘旁0.5 cm处纵行切开第3～5肋骨,剪开心包,暴露心脏,结扎冠状动脉前降支,同时将一根直径2 mm塑料管置于结扎线与冠状动脉之间,拉紧结扎线使塑料管压迫引起冠状动脉闭塞,造成急性心肌缺血。缺血35 min后,抽去塑料管,再灌注120 min。两组大鼠于冠状动脉结扎和再灌注前1 min分别由左心腔缓慢注射生理盐水或荷叶黄酮。

　　1.4 标本取材

　　处死动物后,取出心脏,生理盐水反复冲洗后，于多聚甲醛固定液中固定24 h。心肌组织经过固定后,常规冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、4 μm厚连续切片，然后贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上备用。

　　1.5 免疫组化检测方法

　　应用苏木精伊红染色方法，观察心肌组织形态学的改变情况。应用免疫组化方法测定心肌组织中Bax、Bcl2及Caspase3的表达，操作严格按说明书进行(免疫组化检测相关试剂均由武汉博士德生物有限公司提供)。采用OLYMPUS BX50获得显微图像。Bax、Bcl2及Caspase3的阳性表达均为棕黄色颗粒，且均定位于心肌细胞的胞浆。应用美国Simple PCI图像分析系统进行平均吸光度测定，每张切片测定5个视野取平均值，以其作为切片的测定值。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS 11.0及PPMS 1.5[3]统计软件进行处理。数据以±s表示，多组比较应用F检验，组间两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 心肌组织形态学变化

　　对照组苏木精伊红染色示心肌细胞结构清晰，层次清楚，无细胞水肿;模型组可见细胞水肿，部分细胞结构不清，密度不均,有细胞簇聚现象;治疗组可见细胞水肿较实验组明显减轻。

　　2.2 Bax、Bcl2及Caspase3的测定

　　Bax、Bcl2及Caspase3均表达在染色阳性心肌细胞的胞浆或胞膜，呈现程度不同、基本均匀的棕黄色颗粒。与对照组和治疗组相比较，模型组Bax与Casepase3的表达均明显增高，Bcl2的表达明显降低(F=3.33～4.17,q=3.34～8.03,P<0.05)。见表1。

　　3 讨 论

　　自从1960年JENNINGS第一次提出心肌IRI　表1 各组相关指标测定结果比较注：*模型组有4只大鼠死亡，#治疗组有2只大鼠死亡的概念以来,其已经成为心血管研究的热点问题。目前研究表明，细胞凋亡在心肌IRI过程中有着极其重要的作用[4,5]。凋亡对于细胞的发展及自身的稳定性有重要作用，但其不正常的表达常导致一些变性疾病。随着对细胞凋亡的深入研究发现，凋亡的发生与许多基因的调控有关[5]。Bax和Bcl2是目前最受重视的一对凋亡调控基因。Bcl2通过防止受损DNA翻译成参与细胞凋亡基因的信号，或者通过这些基因产物的活动来阻断细胞凋亡的最后通路，起到保护细胞的作用[6]。Bax是1993年在人前B细胞基因文库发现的一种新基因,与Bcl2有21%的同源性，其表达产物在功能上与Bcl2相反，该蛋白可与Bcl2蛋白形成异源二聚体，从而抑制Bcl2的功能。研究表明，当Bax过表达时，可促进细胞凋亡[7～9]。

　　荷叶是睡莲科植物莲的叶片。荷叶在食用和药用两方面均有较广泛的应用，它除了含有碳水化合物、脂质、蛋白质、单宁等常规化学成分外，还含有多种生物碱和黄酮类化合物。现代研究表明，荷叶黄酮具有降脂减肥、抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒等作用[1]。本文结果显示，模型组大鼠心肌组织中Bax的表达明显高于对照组，Bcl2的表达明显低于对照组(P<0.05)，说明在心肌缺血再灌注过程中，心肌细胞发生了凋亡。而给予荷叶黄酮治疗大鼠的心肌组织中Bax的表达明显低于模型组，Bcl2的表达明显高于模型组(P<0.05)，说明荷叶黄酮抑制了心肌细胞的凋亡，对心肌缺血再灌注可能具有保护作用。

　　Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡下游的关键酶，细胞凋亡的诱导实质上是通过 Caspase蛋白的次序激活来实现的。至今已发现14个家族成员，Caspase3是其家族最重要成员之一，也是其他成员级联反应的必经之路，大多数触发细胞凋亡的因素，最终均需要通过Caspase3 介导的信号传导途径来实现。可以说，Caspase3 是细胞凋亡的执行因子。在本实验中，与对照组相比，模型组Caspase3的表达明显升高(P<0.05);而与模型组比较，治疗组Caspase3的表达明显减少(P<0.05)。表明荷叶黄酮对大鼠心肌IRI具有保护作用的机制可能与抑制Caspase3的表达有关。

　　总之，细胞凋亡在心肌IRI过程中有着极其重要的作用，而荷叶黄酮对大鼠心肌IRI具有保护作用，其作用机制可能与上调Bcl2、下调Bax以及抑制Caspase3的表达，减少细胞凋亡有关。

【参考文献】
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　　(本文编辑 马伟平)齐鲁医学杂志2009年12月第24卷第6期 Med J Qilu, December 2009, Vol.24, No.6doi:10.3969/j.issn.10080341.2009.06.021

作者单位：(1 青岛大学医学院人体解剖学教研室，山东 青岛 266021; 2 青岛市第三人民医院神经内科)