乳癌新辅助化疗后MCM5、Ki67和CerbB2表达变化及意义

【摘要】  目的 观察人乳癌新辅助化疗前后MCM5、Ki67 和CerbB2蛋白的表达情况，探讨其与化疗效果的关系。方法 采用免疫组化法检测新辅助化疗前后40例乳癌标本中MCM5、Ki67和CerbB2的表达。结果新辅助化疗有效率为77.5%。化疗前MCM5和Ki67蛋白阳性表达显著高于化疗后(Z=-3.94、-3.04，P<0.01)，而化疗前后CerbB2蛋白阳性表达差异无显著性(Z=-1.60，P>0.05);化疗前MCM5蛋白阳性表达显著高于Ki67(Z=-4.02，P<0.01)。化疗有效组(31例)MCM5蛋白阳性表达显著高于化疗无效组(9例)(Z=-3.57，P<0.01)，而CerbB2蛋白阳性表达显著低于化疗无效组(Z=-3.92，P<0.01)。结论 ET方案新辅助化疗有较好的疗效，可能通过抑制MCM5、Ki67蛋白的表达来阻止乳癌细胞的增殖。MCM5高表达、CerbB2阴性者化疗更为敏感，二者可作为临床指导乳癌化疗的分子生物学指标。

【关键词】  乳腺肿瘤;化学疗法,辅助;MCM5蛋白;Ki67抗原;受体,erbB2

EXPRESSION OF MCM5, Ki67, AND CerbB2 AFTER NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY OF BREAST CANCER AND ITS SIGNIFICANCE HUANG PIGN, REN ZHANPING, MO JUNYANG, et al (Department of Breast Surgery, LiuzhouPeople’s Hospital, Liuzhou 545006, China); Objective To study the expressions of MCM5, Ki67, and CerbB2 before and after neoadjuvant chemotherapy (NC) in breast cancer patients, analyze their relationship with response to NC. Methods The expressions of MCM5, Ki67, and CerbB2 before and after NC were examined by immunohistochemistry in 40 patients with breast cancer. Results The overall response rate to NC was 77.5%. The positive expression of MCM5 and Ki67 before the therapy was significantly higher than that after (Z=-3.94,-3.04;P<0.01), while there was no significant difference in the expression of CerbB2 between before and after chemotherapy (Z=-1.60,P>0.05). Before the chemotherapy, the positive expression of MCM5 was significantly higher than that of Ki67 (Z=-4.02,P<0.01). The positive MCM5 in the chemotherapyeffective group (31 cases) was higher than that of the chemotherapyuneffective (9 cases) (Z=-3.57,P<0.01), and the positive expression of CerbB2 was significantly lower (Z=-3.92,P<0.01). Conclusion Neoadjuvant chemotherapy with ET regimen is effective for breast cancer, which inhibits the proliferatation of cancer cells by restraining the expression of MCM5 and Ki67. Patients with high expression of MCM5 and negative CerbB2 are more likely to respond to the therapy. Both MCM5 and CerbB2 can be used as molecular biological markers to guide chemotherapy for breast cancer.

　　[KEY WORDS] Breast neoplasms; Chemotherapy, adjuvant; MCM5 protein; Ki67 antigen; Receptor, erbB2

　　新辅助化疗是乳癌综合治疗的重要组成部分，术前其主要通过抑制肿瘤细胞增殖、杀灭肿瘤细胞，从而缩小肿瘤体积，降低肿瘤分期、分级。了解乳癌对化疗药物的敏感性，有利于术后治疗方案的选择。由于乳癌的高度异质性，即使病理类型、临床分期和化疗方案相同的病人，其治疗效果也存在很大差异。研究乳癌相关生物学标志物与新辅助化疗效果之间的关系，对指导个体治疗有重要意义。为此，本研究采用免疫组化技术检测新辅助化疗前后乳癌病人MCM5、Ki67和CerbB2表达的变化，分析三者与化疗效果的关系并探讨其作为乳癌新辅助化疗效果预测因子的意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选取我院2005年6月～2008年6月拟手术的原发性乳癌病人40例，均为女性，年龄26～74岁，中位年龄49.5岁。以上病例术前均未接受过化疗、放疗及内分泌治疗，术前进行穿刺活检，并经病理确诊为乳腺浸润性导管癌。参照2003年WHO乳癌TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期26例，Ⅲ期10例。有淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者16例。

　　1.2 新辅助化疗方案

　　术前采用ET方案化疗，表阿霉素(EPI)70～90 mg/m2，第1天，静脉滴注;紫杉醇(PTX)135～175 mg/m2，第1天，静脉滴注，每21 d为1个周期，共3个周期。

　　1.3 新辅助化疗效果评价

　　化疗效果以原发实体瘤的体积变化来衡量。采用B超或钼靶X线测量乳癌肿瘤大小。化疗前后肿瘤体积计算采用椭圆体计算公式：4π/3×宽轴半径×长轴半径×高轴半径[1]。按照国际抗癌联盟(UICC)实体瘤通用疗效评定标准进行疗效评价。完全缓解(CR)：所有已知病灶消失至少达4周;部分缓解(PR)：可测量的病灶总体积减少≥50%至少达4周以上，及病情无进展或无其他病灶出现;病情稳定(SD)：一个或多个可测量的病灶总体积减少<50%或增加<25%，时间至少长达4周;病情进展(PD)：一个或多个可测量的病灶总体积增加超过25%。总有效率=CR率+PR率。

　　1.4 免疫组化检测

　　鼠抗人MCM5(CRCT51) 单克隆抗体购自Neo Markers公司，抗体稀释度为1∶100。即用型兔抗人Ki67(SP6)单克隆抗体、兔抗人CerbB2(SP3)单克隆抗体和SP试剂盒(Kit9710)购自福州迈新生物公司。采用SP法免疫组化技术检测，切片均需高压水煮修复抗原，免疫组化染色操作步骤按说明书进行，用已知乳癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.5 免疫组化染色结果判断

　　MCM5和Ki67均以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性标志。二者染色结果判断参照BUKHOLM等[2]提出的标准。计数≥500个肿瘤细胞，以细胞核内出现棕黄色颗粒且阳性细胞数<10%为(-)，10%～30%为(+)，31%～70%为()，>70%为()。CerbB2阳性细胞为细胞膜着色，不着色为阴性(-);着色阳性细胞数大于10%为阳性，其中着色弱且不连续为弱阳性(+);着色中等且部分不连续为阳性();着色强且连续为强阳性()。

　　1.6 统计学方法

　　应用SPSS 10.0软件对数据进行秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 新辅助化疗的近期疗效

　　40例乳癌病例中,CR者2例(5.0%)，PR者29例(72.5%)，SD者9例(22.5%)，无PD病例，总有效率为77.5%。

　　2.2 新辅助化疗前后MCM5、Ki67 和CerbB2的表达

　　MCM5、Ki67蛋白阳性定位于乳癌细胞核，CerbB2蛋白阳性定位于细胞膜，三者在间质细胞中均无着色。化疗前MCM5、Ki67蛋白阳性表达均显著高于化疗后(Z=-3.94、-3.04，P<0.01)，而化疗前后CerbB2蛋白阳性表达差异无显著意义(Z=-1.60，P>0.05)。化疗前MCM5蛋白阳性表达高于Ki67，差异有显著意义(Z=-4.02，P<0.01)，化疗后MCM5与Ki67蛋白阳性表达差异无显著性(Z=-1.32，P>0.05)。见表1。

　　2.3 MCM5、Ki67、CerbB2的表达与化疗效果的关系

　　化疗有效组(CR+PR)MCM5蛋白阳性表达显著高于化疗无效组(SD)(Z=-3.57，P<0.01)，而化疗有效组CerbB2蛋白阳性表达显著低于化疗无效组(Z=-3.92，P<0.01)，Ki67蛋白表达两组差异无显著性(Z=-1.23，P>0.05)。见表1。

　　3 讨 论

　　乳癌作为一种全身性疾病，化疗已成为其治疗的一个重要手段。新辅助化疗效果肯定，被越来越多地应用于临床，其优点为：①缩小原发病灶，便于手术，争取保乳;②降低肿瘤细胞增殖活性，减少术中播散机会，利于消灭微小病灶，减少耐药机会;③了解肿瘤对化疗药物的敏感性，帮助制定合理的术后化疗方案。本研究采用ET方案化疗3个周期，总有效率达77.5%，完全缓解率5.0%，证实了新辅助化疗能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，使肿瘤缩小甚至消失，临床疗效好。　表1 新辅助化疗前后乳癌组织MCM5、Ki67、CerbB2的表达及与疗效的关系

　　众多研究表明，乳癌的发生、发展与细胞异常增殖有关。乳癌新辅助化疗效果预测因子方面的研究较多，分歧也较大，目前还没有公认的单一预测因子。因此，联合多种潜在的预测因子对乳癌新辅助化疗的效果进行预测，可能有效提高预测的准确性。Ki67作为细胞核增殖抗原，一些观点认为其是反映细胞增殖活性的重要指标[3]。但其对化疗效果的评价各家报道不一，有文献报道Ki67表达下降与肿瘤缓解相关，新辅助化疗使Ki67表达下调。齐鲁医学杂志2009年12月第24卷第6期 Med J Qilu, December 2009, Vol.24, No.6本研究显示，化疗后Ki67蛋白表达显著低于化疗前，化疗后Ki67表达下调，提示新辅助化疗显著抑制了肿瘤细胞的增殖。化疗有效组Ki67的蛋白表达虽然高于化疗无效组，但差异无显著性，未发现Ki67表达与化疗敏感性有关，这与卫燕等[4]研究结果相一致。已有部分研究显示，Ki67并非细胞增殖所必需的因子，其在G1早期并无表达，而是在核糖体生物合成过程中发挥作用[5]，因此Ki67可能仅能鉴定部分增殖细胞。Ki67蛋白表达对疗效的评价有待于扩大样本进一步观察。

　　微小染色体维持蛋白(MCMs)是近期发现的一组DNA复制的准许因子，可启动DNA复制与细胞增殖密切相关的蛋白家族。在正常情况下，正常细胞中的MCM蛋白的mRNA水平随细胞周期的变化而改变，MCM蛋白的表达在G1/S期转换达峰值，当细胞进入G0期和分化、衰老时，MCM表达水平下降甚至不能测出。分子生物学研究表明，MCM是一种多功能蛋白质，它不但是DNA复制和延伸的重要组成部分，而且作为细胞增殖的一种新标志物比Ki67更具特异性和准确性[6]。MCM蛋白家族是一组在序列上高度同源、功能上密切相关的蛋白质，MCM5是MCM蛋白复合物的成分之一，可直接反映MCM蛋白的表达水平。段智等[7]报道，在乳癌组织中MCM5阳性率为70.4%，明显高于正常乳腺组织。本研究显示，化疗前乳癌MCM5阳性表达率为92.5%，MCM5蛋白阳性表达()～()者占72.5%，化疗前MCM5蛋白表达水平显著高于化疗后，化疗有效组MCM5蛋白表达水平显著高于化疗无效组。表明新辅助化疗可降低乳癌癌细胞的DNA合成速度，有明显的抑癌作用，并与化疗效果密切相关，即MCM5表达水平高，肿瘤细胞增殖活跃的乳癌化疗效果较好，提示化疗药物对增殖活性高的肿瘤细胞杀伤力更强，预示着新辅助化疗可能使原本预后较差的MCM5高水平表达组病人更加受益。我们在分析乳癌化疗前MCM5与Ki67蛋白表达水平的关系中发现，化疗前MCM5蛋白表达水平显著高于Ki67，这可能与MCM5更早地参与DNA复制[8]，更多地参与细胞的有丝分裂，更准确地标识处于增殖中的细胞有关[9]，表明二者均能够反映肿瘤细胞的增殖活性，但MCM5较Ki67有更高的敏感性和特异性，更能准确反映细胞增殖状态，是一种较为理想的细胞增殖标志物，同时在判断化疗效果，指导临床化疗方面有重要意义。

　　CerbB2是定位于17q21上的一种相对分子质量为185 000的原癌基因，对细胞的分化、增殖发挥重要的调节作用。它不仅能有效预测乳癌病人的预后，而且可以预测乳癌对多种治疗方法的敏感性。本研究显示，化疗有效组CerbB2蛋白阳性表达低于化疗无效组，而化疗前后CerbB2蛋白阳性表达差异无显著性，预示CerbB2蛋白阴性的病人化疗有效率高，但新辅助化疗并不能完全改变CerbB2的增殖状况。

　　综上所述，乳癌新辅助化疗后MCM5和Ki67蛋白阳性表达均呈下降趋势，而CerbB2无明显变化;MCM5高表达、CerbB2阴性者化疗有效率高，二者可作为指导乳癌化疗并预测化疗敏感性的分子生物学指标。

【参考文献】
  　　[1]BOUGHEY J C, PEINTINGER F, MERICBERNSTAM F, et al. Impact of preoperative versus postoperative chemotherapy on the extent and number of surgical procedures in patients treated in randomized clinical trials for breast caner[J]. Ann Surg, 2006,244(3):464470.

　　[2]BUKHOLM I R, BUKHOLM G, HOLM R, et al. Association between histology grade, expression of HsMCM2, and cyclin A in human invasive breast carcinomas[J]. J Clin Pathol, 2003,56(5):368373.

　　[3]牛兆山,纪祥瑞. 子宫内膜腺癌组织中MVD与临床病理因素及细胞增殖关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(4):335340.

　　[4]卫燕,李金峰,王天峰,等. 激素受体和Ki67的表达与乳腺癌蒽环类新辅助化疗疗效的相关性[J]. 北京大学学报：医学版, 2007,39(5):481483.

　　[5]MACCALLUM D E, HALL P A. The location of pKi67 in the outer dense fibrillary compartment of the nucleolus points to a role in ribosome biogenesis during the cell division cycle[J]. J Pathol, 2000,190(5):537544.

　　[6]BAILIS J M, FORSBURG S L. MCM protein: DNA damage,mutagenesis and repair[J]. Curr Opin Genet Dev, 2004,14(1):1721.

　　[7]段智,李代强. MCM5和E2F2在乳腺癌组织中的表达及意义[J]. 中国现代医药杂志, 2007,9(4):1921.

　　[8]WILLIAMS G H, SWINN R, PREVOST A T, et al. Diagnosis of oesophageal cancer by detection of minichromosome maintenance 5 protein in gastric aspirates[J]. Br J Cancer, 2004,91(4):714719.

　　[9]KORKOLOPOULOU P, GIVALOS N, SAETTA A, et al. Minichromosome maintenance proteins 2 and 5 expression in muscleinvasive urothelial cancer: a multivariate survival study including proliferation markers and cell cycle regulators[J]. Hum Pathol, 2005,36(8): 899907.

作者单位：(柳州市人民医院，广西 柳州 545006 1 乳腺外科; 2 病理科)