子宫内膜癌组织APE、HIF1α和VEGF表达及意义

【摘要】  　　目的 了解无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(APE)、低氧诱导因子1α（HIF1α）和血管内皮生长因子（VEGF）在子宫内膜癌中的表达及其意义,并探讨APE与HIF1α、VEGF蛋白表达之间的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测APE、HIF1α和VEGF在44例子宫内膜癌、22例子宫内膜不典型增生及18例正常子宫内膜组织中的表达情况。结果 APE、HIF1α和VEGF在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌组织中表达的阳性率比较，差异均有显著性（χ2=8.371～18.589,P<0.05）。APE在各种子宫内膜组织细胞内的定位有所不同，正常子宫内膜组织APE表达于细胞核内，子宫内膜不典型增生组织中6例(42.86%)细胞质中有APE表达,子宫内膜癌组织中24例(70.59%)细胞质有APE表达，APE在3种组织细胞内定位差异有显著性（χ2=12.701，P<0.05）。而且细胞质中有APE表达的子宫内膜癌较无表达者VEGF阳性率显著增加(χ2=3.973，P< 0.05)。APE蛋白在子宫内膜癌组织细胞质中的阳性表达率与肿瘤的分化程度及病理分期有关（χ2=11.059、9.969，P<0.01、0.05）。子宫内膜癌组织APE及HIF1α的表达均与VEGF的表达有相关性(r=0.626、0.469,P<0.01)，且APE与HIF1α的表达也有相关性（r=0.612,P<0.01）。结论 子宫内膜癌组织中APE、HIF1α和VEGF蛋白参与子宫内膜癌的发生发展，APE蛋白与HIF1α可能通过上调VEGF蛋白的表达,促进肿瘤的血管生成而促进子宫内膜癌的发生。

【关键词】  子宫内膜肿瘤；DNA(无嘌呤或无嘧啶位点)裂合酶　低氧诱导因子1α　血管内皮生长因子类　免疫组织化学

　　EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF APE, HIF1α, AND VEGF IN ENDOMETRIAL CARCINOMA 

　　LI FAHONG, JI XINQIANG, WU JINGLI

　　 (Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To study the expression of apurinic endonuclease (APE), hypoxiainducible factor1 alpha (HIF1α), and vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometrial carcinoma (EC) and investigate the relationship between APE, and HIF1α and VEGF protein expression.  Methods Immunohistochemistry technique was used to detect the expression of APE, HIF1α, and VEGF protein in 44 cases of EC, 22 of atypical hyperplasia and 18 of normal endometrium. Results The expression rates of APE, HIF1α, and VEGF in normal endometrium, atypical hyperplasia and EC were significantly different among the three groups (χ2= 8.371-18.589,P<0.05). The location of APE inside endometrial cells was different in the three different endometrim tissues. APE was expressed in the nucleus of normal endometrial cells. Cytoplasm location of APE was found in six cases (42.86%) of atypical hyperplasia and in 24 (70.59%) of EC, the difference of location was significant among the three different endometrium tissues (χ2=12.701,P<0.05). The expression of the VEGF in EC with positive cytoplasm APE expression was significantly higher than in EC without cytoplasm APE expression (χ2=3.973,P<0.05). The APE expression rate in EC was associated with the differentiation and pathological staging of the tumor (χ2=11.059,9.969;P<0.01,0.05). The expression of APE and HIF1α in EC was positively correlated with VEGF expression (r=0.626,0.469;P<0.01) and the expression of APE was also positively correlated with HIF1α (r=0.612,P<0.01). Conclusion APE, HIF1α, and VEGF are involved in the carcinogenesis and development of EC. It is probably that APE and HIF1α upregulate the expression of VEGF, promote angiogenesis and result in the occurrence of the cancer.
   
　　［KEY WORDS］ endometrial neoplasms; DNA(apurinic or apyrimidinic site) lyase; hypoxiainducible factor1 alpha; vascular endothelial growth factors; immunohistochemistry
   
　　无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(APE)基因作为一种双功能蛋白,除了修复氧和烷基化损伤外, 还具有氧化还原功能，通过维持细胞内多种转录因子的激活还原状态，而参与多种关键的细胞反应，如氧化应激[1]、转录因子调节[2]，在多种人类恶性肿瘤中存在该基因的异常表达。新近有研究结果证实，APE与低氧诱导因子1α（HIF1α）、信号转换和转录激活因子3（STAT3)、组蛋白乙酰转移酶（CBP/p300）一起共同组成转录复合体,从而调控血管内皮生长因子（VEGF）的表达[3]。VEGF是最重要的血管生长因子,在多种肿瘤中高表达。本研究应用免疫组织化学方法,检测APE与HIF1α及VEGF在子宫内膜癌组织中的表达情况,并结合病理分级进行分析,旨在探讨APE、HIF1α及VEGF蛋白在子宫内膜癌组织中的表达及其意义,以及三者之间的关系。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本及来源
   
　　从2006—2007年青岛大学医学院附属医院收治的子宫内膜癌病例中选取临床病理资料完整，术前未行化疗、放疗的内膜癌组织石蜡标本44例,按照FIGO 1998年子宫内膜癌手术病理分期,Ⅰ期16例, Ⅱ期12例, Ⅲ期9例，Ⅳ期7例；病理分级：高分化13例,中分化17例，低分化14例，均经临床病理检查确诊。病人年龄27～74岁,平均56.95岁。另选取经诊断性刮宫术确诊为子宫内膜不典型增生标本22例；因子宫肌瘤手术切除的正常子宫内膜18例，其中增殖期子宫内膜组织10例,分泌期子宫内膜组织8例。

　　1.2  APE、HIF1α和VEGF蛋白表达检测
   
　　采用免疫组织化学PV6000二步法检测APE及HIF1α抗体、VEGF蛋白表达，按常规步骤进行操作。鼠抗人APE抗体、鼠抗人HIF1α抗体、鼠抗人VEGF 抗体、PV6000 试剂盒(通用型)、DAB 显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。分别用PBS代替3种一抗作为阴性对照,用已知阳性组织切片作为阳性对照。

　　1.3  APE、HIF1α和VEGF蛋白染色结果判断
   
　　APE蛋白阳性染色为胞核或胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒；HIF1α蛋白阳性染色为胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒；VEGF蛋白阳性染色呈棕黄色,主要存在于细胞浆, 胞膜和胞浆同时着色亦为阳性。随机选取5个高倍视野,计数500个肿瘤细胞,阳性细胞数≥10%为蛋白表达阳性,阳性细胞数<10%记为阴性。染色强度分为+(黄色)、(棕黄色)、(褐色)3个等级。

　　1.4  统计方法
   
　　应用SPSS 11.5软件包进行数据处理，数据间比较采用χ2 检验、Fisher精确检验，相关性采用Spearman等级相关分析。

　　2  结果

　　2.1  APE、HIF1α、VEGF蛋白在不同性质子宫内膜组织中的表达比较
   
　　在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌组织中,APE的阳性表达率分别为38.9%、63.6%、77.3%,HIF1α阳性表达率分别为22.2%、54.4%、72.7%,VEGF阳性表达率分别为16.7%、45.5%、75.0%，APE、HIF1α和VEGF在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌组织中的阳性表达率比较，差异均有显著性（χ2=8.371～18.589,P<0.05）。

　　2.2  APE在不同性质子宫内膜组织细胞胞质中的表达
   
　　APE在正常子宫内膜组织中无胞质表达;子宫内膜不典型增生中6例(42.86%)细胞质有APE表达,子宫内膜癌中24例(70.59%)细胞质有APE表达，差异有显著性（χ2=12.701，P<0.05）。细胞质APE阳性表达的子宫内膜癌较无表达者VEGF阳性率显著增加(χ2=3.973，P<0.05)。

　　2.3  APE蛋白胞质阳性表达率与肿瘤分化程度及病理分期的关系
   
　　子宫内膜癌组织中APE蛋白胞质阳性表达率与肿瘤分化程度及病理分期密切相关，子宫内膜癌分期越晚，APE的胞质移位率越高，差异有统计学意义（χ2=11.059，P<0.05）；组织分化恶性度越高，APE的胞质移位率越高（χ2=9.969，P<0.05）。见表1。表1  APE蛋白胞质阳性表达与子宫内膜癌分级、分期的关系（略）

　　2.4  APE、HIF1α和VEGF表达的相关性
   
　　在子宫内膜癌组织中，APE与VEGF的表达呈正相关(r=0.626,P<0.01)，HIF1α与VEGF的表达呈正相关（r=0.469,P<0.01）,而且APE与HIF1α的表达间也呈正相关性(r=0.612,P<0.01)。见表2。表2  APE与HIF1α、VEGF表达的相关性（略）

　　3  讨论
   
　　APE是一种具有 DNA修复和氧化还原功能的双功能蛋白，其功能的异常可导致肿瘤发生。在骨肉瘤、宫颈癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌中APE的表达水平较正常组织显著升高[46]。王志新等[7]证实，APE在肾癌细胞胞质中的表达率为43.1%，在正常肾组织细胞质中的表达率为9.0%，二者差异有显著性，说明APE与肿瘤发生密切相关。张云蒿等[8]认为，APE蛋白表达和定位的改变可能是非小细胞肺癌病人预后不良的指标之一。TANNER等[9]检测APE蛋白在卵巢癌中的表达，结果表明APE蛋白核表达和肿瘤进展明显相关，Ⅲ和Ⅳ期病人核表达明显比Ⅰ和Ⅱ期强， APE核表达也明显与组织学分级相关，而APE胞质和间质表达与病情进展无关。
   
　　HIF1α是调节细胞内氧代谢的关键因子之一,它能通过诱导 VEGF和糖酵解相关酶的表达,增加供血、供氧、供能, 改善低氧状态，与肿瘤的发生、发展密切相关[10]。FOLKMAN[11]研究表明，VEGF能增强内皮细胞迁移、增殖功能,并逆转内皮细胞的“老化 ”,因而具有刺激血管生成的作用。新近有研究采用细胞核抽提物免疫沉淀实验证实， HIF1α、STAT3、CBP/p300和APE都存在于VEGF启动子中[1213]。APE除了增加转录因子的 DNA亲和力外,还能促进转录复合体中p300的募集;也有利于包括 HIF1α和STAT3在内的多种转录因子的 DNA结合和转录激活。激活的 HIF1α和 STAT3转移至细胞核内并与APE结合共同组成 VEGF启动子,最后募集更多的p300组成转录复合体激活 VEGF基因表达，从而促进血管生成,有利于肿瘤的生长和转移。
   
　　本文检测44例子宫内膜癌、22例子宫内膜不典型增生及18例正常子宫内膜组织中APE、HIF1α、VEGF蛋白的表达,结果显示，APE在子宫内膜组织中有两种表达模式，即胞核表达、胞核和胞质共表达。在子宫内膜癌中APE的阳性表达率明显高于正常子宫内膜组织，而且子宫内膜癌组织中APE的表达部位与正常子宫内膜组织有所不同,正常子宫内膜组织APE的表达定位于细胞核中,无移位于胞质的异常表达；而54.44%的子宫内膜癌组织发生了APE表达的胞质移位，提示APE蛋白的异常表达可能与子宫内膜癌的发生有关。
   
　　本文进一步以有无APE胞质移位表达将子宫内膜癌分为两组进行研究,结果显示，APE胞质移位与子宫内膜癌的分级与分期有关，随着子宫内膜癌分期的增加，组织分化恶性度的增高，APE的胞质移位率增高；而且有APE胞质表达的子宫内膜癌组织中VEGF阳性表达率显著高于无APE胞质表达者，提示APE胞质移位表达可能参与调控VEGF的高表达,从而促进子宫内膜癌血管生成。本研究结果还显示，APE、HIF1α蛋白的表达与VEGF的表达呈正相关，而且APE蛋白与HIF1α的表达也呈正相关。提示APE与HIF1α蛋白可能通过上调VEGF蛋白的表达,促进肿瘤血管的生成而促进子宫内膜癌的发生。
   
　　综上所述,APE移位于胞质的异常表达可能与子宫内膜癌的发生有关， APE与HIF1α蛋白可能通过上调VEGF蛋白的表达,促进肿瘤血管的生成而促进子宫内膜癌的发生。研究三者在子宫内膜癌中的表达,并干预其中某个因素,研究其他因素的相应变化,有可能为临床治疗提供依据和方向。抑制APE蛋白及其作用途径,可能为子宫内膜癌的诊断、治疗及预防开辟一条新的途径。

【参考文献】
  　　[1]WONG D, DEMPLE B. Modulation of the 5′deoxyribose5phosphatelyase and DNA synthesis activities of mammalian DNA polymerasebeta by apurinic/apyrimidinic endonuclease 1[J]. J Biol Chem, 2004,279(24):2526825275.

　　[2]GROS L, ISHCHENKO A A, IDE H, et al. The major human AP endonuclease (Ape1) is involved in the nucleotide incision repair pathway[J]. Nucleic Acids Res, 2004,32(1):7381.

　　[3]GRAY M J, ZHANG J, ELL IS L M, et al. HIF1alpha, STAT3,CBP/p300 and Ref21/APE are components of a transcrip tional comp lexthat regulates Src2 dependent hypoxia induced exp ression of VEGF inpancreatic and prostate carcinomas [J]. Oncogene, 2005,24(19):31103120.

　　[4]WANGD, LUO M, KELLEYM R. Human apurinic endonuclease 1(APE1) expression and prognostic significance in osteosarcoma: enhanced sensitivity ofosteosarcoma to DNA damaging agents using silencing RNA APE1 expression inhibition[J]. Mol Cancer Ther, 2004,32(6):679686.

　　[5]MOORE D H, MICHAEL H, TRITT R, et al. Alterations in the expression of the DNA repair/redox enzymeAPE/ref1 in epithelialovarian cancers[J]. Clin Cancer Res, 2000,6(2):26022609.

　　[6]KELLEYM R, CHENGL, FOSTER R, et al. Elevated and altered expression of the multifunctional DNA base excision repair and redox enzyme Ape1/ref21 in prostate cancer[J]. Clin Cancer Res, 2001,7(4):824830.

　　[7]王志新,张刚,连树林,等. 肾细胞癌中Ref1/APE 的表达特点及其意义[J]. 中国老年医学杂志, 2007,27(7):1277.

　　[8]张云蒿,范士志,王东, 等. APE1 在非小细胞肺癌中的表达特点及其与预后的关系[J]. 第三军医大学学报, 2007,29(9):776.

　　[9]TANNER B, GRIMME S, SCHIFFER I, et al. Nuclear expression of apurinic/apyrimidinic endonuclease increases with progression of ovarian carcinomas[J]. Gynecol Oncol, 2004,92(2):568577.

　　[10]YASUDA S, ARII S, MORIA, et al. Hexokinase Ⅱand VEGF expression in liver tumors: corredlation with hypoxiainducible factor1 alpha and its significance[J]. Hepatol, 2004,40(1):117123.

　　[11]FOLKMAN J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis[J]. Semin Oncol, 2002,29(6 Suppl 16):1518.

　　[12]GRAY M J, ZHANG J, ELLIS L M, et al. HIF 1 alpha, STAT3,CBP/p300 and Ref1/APE are componentsof a transc riptional complex that regulates Src 2 dependent hypoxia 2 induced expression of VEGF in pancreatic and prostate carcinomas[J]. Oncogene, 2005,24 (19):31103120.

　　[13]ZIEL K A, CAMPBELL C C, W ILSON G L, et al. Ref21/APE is critical for formation of the hypoxia inducible transcriptional complex on the hypoxic response elementof the ratpulmonary artery endothelial cell VEGF gene[J]. FASEB J, 2004,18(9):986998.