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【摘要】 目的 探讨低剂量照射对小鼠S180肉瘤组织细胞周期蛋白E（Cyclin E）和增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法 昆明种雄性小鼠右后肢腹股沟皮下接种S180肉瘤细胞，随机分成对照组（假照组）、照射组。接种后1周以75 mGy的γ射线全身照射照射组小鼠，于照射后12、24、48及72 h处死两组小鼠，直接测量肿瘤直径，取瘤组织用PV二步法半定量检测Cyclin E、PCNA表达情况。结果 与假照组相比，75 mGy的γ射线全身照射后小鼠肿瘤生长缓慢（t=2.19，P＜0.05）。低剂量照射后各组小鼠Cyclin E表达与假照组比较差异无显著性（P＞0.05）；照射后48 h小鼠瘤组织PCNA表达较假照组明显下降（u=2.34，P＜0.05）。结论 低剂量照射可降低Cyclin E、PCNA的表达，从而抑制肿瘤生长，对低剂量照射抗肿瘤机制的研究有一定的指导意义。
【关键词】 全身照射 肉瘤180 细胞周期蛋白E 增殖细胞核抗原
EFFECTS OF LOW DOSE RADIATION ON Cyclin E AND PCNA EXPRESSION IN MICE WITH S180 SARCOMA
MA SHAOLIN, YU HONGSHENG
(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
［ABSTRACT］ Objective To study the effects of low dose radiation (LDR) on the expressions of cell cycle protein E (Cyclin E) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in mice with S180 sarcoma. Methods S180 sarcoma cells were inoculated into subcutaneous tissue of the right hind inguinal area in Kunming male mice. One week after inoculation, the mice were randomly divided into two groups: the radiation group and control group (sham radiation). The radiation group received 75 mGy wholebody γirradiation. All mice were sacrificed at 12, 24, 48 and 72 h after irradiation. The tumor diameter was measured and the expression of Cyclin E and PCNA detected by PV immunohistochemistry technique. Results Compared with the control group,the tumor growth in the radiation group was significantly slowed down after LDR (t=2.19,P＜0.05). There was no significant difference in Cyclin E expression between the two groups (P＞0.05). Fortyeight hours after LDR, the PCNA expression in the radiation group was significantly lower than that of the control (u=2.34,P＜0.05). Conclusion LDR can reduce the expressions of cellcycle related proteins PCNA and Cyclin E, and inhibit tumor growth. The results of the present study provide useful information for further study on the antitumor mechanism of LDR.
［KEY WORDS］ wholebody irradiation; sarcoma 180; Cyclin E; proliferating cell nuclear antigen
1986年，联合国原子照射效应科学委员会 (UNSCEAR)报告指出，就人体照射而言，低水平照射是指剂量在0.2 Gy以内的低传能线密度 (LET)照射或0.05 Gy以内的高LET照射，同时剂量率在0.05 mGy/min以内。实际研究中把照射剂量符合上述条件而剂量率高于0.05 mGy/min者称为低剂量照射(LDR)。实验研究结果显示，LDR最佳剂量为75 mGy，不仅能抑制机体肿瘤的生长，而且能阻滞肿瘤细胞周期进程［1］。目前射线对肿瘤细胞周期影响机制的分子水平研究较少，本文对LDR下的肿瘤细胞周期蛋白E（Cyclin E）、增殖细胞核抗原（PCNA）的表达进行了研究,以深入研究LDR的抑瘤机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
清洁型昆明种小白鼠，雄性，体质量（18±22）g，4～6周龄，由青岛市药检所提供，随机分成荷瘤对照组（假照组）、LDR组，其中假照组与LDR组分别再分为12、24、48及72 h处死组。常规饲养，饮水、食物不限。
1.2 试剂
兔抗Cyclin E抗体（产品编号：bs0573R）购于北京博奥森生物技术公司；鼠抗PCNA抗体（产品编号：ZM0213）、PV免疫组化试剂盒、PBS及DAB显色液购于北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3 肿瘤细胞种植
S180肉瘤细胞(山东医学科学院基础所提供)经小鼠腹腔传代二次，将处于对数生长期的细胞按常规方法制成6.5×1010/L细胞悬液，于小鼠右腹股沟皮下接种6.5×106个(0.1 mL)细胞。
1.4 荷瘤鼠的照射
接种肿瘤后第7天，用游标卡尺测量肿瘤水平方向最大长径a(cm)及垂直方向最大横径b(cm)，各重复测量2次，舍弃肿瘤过大(ab＞2.00 cm2)或过小(ab＜0.20 cm2)的小鼠，取平均值，按下列公式计算肿瘤平均体积：V=1/2 ab2[2]。上述各组比较无差异后，对LDR各组小鼠进行75 mGy低剂量全身照射，照射采用FCC7000型同中心回转式60Co治疗机（山东新华医疗器械厂），源皮距160 cm，用自制纸盒盛装小鼠，机头与纸盒中间放置15 cm×15 cm大小的铅板滤过射线，剂量率为15.9 mGy/min，总剂量为75 mGy，均为一次性全身照射。
1.5 观察指标
1.5.1 肿瘤生长情况
于照射后12、24、48、72 h分别脱颈处死LDR组和假照组小鼠，暴露瘤组织，按上述方法直接计算各组小鼠肿瘤平均体积。
1.5.2 Cyclin E、PCNA半定量测定
取上述肿瘤组织1块，中性甲醛固定，石蜡包埋、切片，脱蜡、脱水，加Cyclin E、PCNA单克隆抗体及相应二抗，显色及复染，显微镜下计数200个细胞。免疫组化阳性结果判断：未见阳性细胞(-)，染色淡或阳性细胞数<25％ 为(+)，染色适中或阳性细胞数占25％～50％ 为()，染色深或阳性细胞数>50％ 为()。
1.6 统计学处理
采用PPMS 1.5[3]统计软件进行统计处理，计量资料数据以±s表示,数据间比较采用t检验；半定量资料比较采用秩和检验。
2 结果
2.1 LDR对肿瘤生长的抑制作用
LDR组照射后肿瘤生长缓慢，72 h组肿瘤平均体积与假照组相比差异有显著意义(t=2.19，P＜0.05)。见表1。表1 LDR对肿瘤生长的影响（略）
2.2 Cyclin E的半定量测定
Cyclin E呈黄色颗粒状为阳性，大部分定位于小鼠种植瘤的细胞核，部分弥散于胞浆中。LDR后各组小鼠Cyclin E表达与假照组比较差异无显著性（P＞0.05）。见表2。PCNA测定结果显示，大部分瘤细胞PCNA呈黄色颗粒状，表达于胞核，部分弥散于胞浆中，部分强阳性表达染色呈深黄色，经照射后48 h组PCNA表达明显减少，与假照组比较差异有显著性（u=2.34，P＜0.05）。见表3。表2 LDR对肿瘤细胞Cyclin E蛋白表达的影响时间，表3 LDR对肿瘤细胞PCNA表达的影响时间（略）
3 讨论
肿瘤的发生是一个多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的过程，其中细胞周期调控失常、细胞增殖失控被认为是肿瘤发生的重要机制。研究结果证明，LDR作用于哺乳动物和人体可诱导适应性反应，增强免疫功能，提高抗肿瘤能力。LDR诱导的适应性反应与细胞周期调控及DNA修复基因的表达有关[4]。叶飞等[5]研究发现，LDR可诱导小鼠脾细胞Cyclin B转录水平增高，进而促进其细胞周期进程，但对cdc2转录水平无影响；相反，较高剂量照射可诱导Cyclin B和cdc2转录水平明显降低，最终发生G2期阻滞。谢大兴等[6]研究小剂量(2、5 Gy)X射线照射后，MOLT4细胞G2期检测点被激活，照射后3～9 h，G2期Cyclins(Cyclin A和Cyclin B1)迅速升高并累积于G2期，G1期Cyclins(Cyclin E)含量逐渐减少；大剂量(10、20 Gy)X射线照射后，细胞G1期检测点被激活，照射后3～9 h，G1期Cyclins(Cydin E)持续性升高并累积于G1期，G2期Cyclins(Cyclin A和Cydin B1)含量下降。本实验对小鼠LDR后，瘤组织中Cyclin E蛋白表达虽与假照组比较无显著性差异，但24、48 h蛋白表达水平呈下降趋势，48 h后Cyclin E表达恢复至假照组水平。Cyclin E是细胞周期G1/S期转移调控的一个正性调节因子，异常情况下Cyclin E蛋白失去周期性表达，而在整个细胞周期中表达水平较高，促使G1/S期转换[7]，使细胞发生异常增殖。小鼠给予LDR后24 h出现了抑瘤效应，可影响肿瘤细胞周期相关蛋白的表达如Cyclin E表达下调，将瘤细胞增殖阻滞在G1期。于洪升等[8]研究显示，LDR下荷瘤小鼠肿瘤细胞在24 h内出现了G1期阻滞，S期明显减少，G2/M期细胞未见变化；48 h后肿瘤细胞G1期阻滞消失，S期明显增加， M期细胞较假照组明显减少，细胞凋亡明显增加。
PCNA是增殖细胞DNA合成不可缺少的物质，在肿瘤细胞周期S期广泛表达。免疫荧光技术和流式细胞定量技术检测均已证实，在正常增殖的和转化的细胞中，PCNA的量发生了明显变化，表明PCNA与细胞增殖明显相关。PCNA的出现与细胞周期中的G1期和S期存在密切联系。利用免疫组化法检测PCNA来评价细胞的增殖状态是一种较为有效的方法。本实验研究显示，大部分S180肉瘤组织中PCNA呈阳性表达，随瘤组织的增长其表达呈强阳性。LDR后24、48 h组PCNA表达减弱，其48 h组与假照组比较差异有显著性。李福宝等[9]研究表明，LDR可使P53基因蛋白表达显著降低。陈龙等[10]研究显示，LDR能明显降低小鼠种植性肝癌PCNA的表达。以上说明了适当的LDR抑制肿瘤生长，影响细胞周期蛋白的表达，阻滞细胞周期的进程，对控制肿瘤的远处转移有一定的意义。齐鲁医学杂志2010年4月第25卷第２期 Med J Qilu, April 2010, Vol.25, No.２
目前，关于电离照射所致离体培养细胞的细胞周期阻滞及其调控的研究进展较快，但对整体水平的分子研究较少，特别是LDR对机体瘤组织细胞周期及其分子调控的研究报道较少。肿瘤细胞周期受多因子的调节，研究LDR对细胞周期蛋白的影响，有助于了解低LDR的抑瘤机制。Cyclins／DNA流式细胞术是近年来发展起来的一种新的细胞周期分析技术，该方法避免了细胞的同步化，其更有助于细胞增殖动力学和细胞周期检测点的检测，可通过该技术进一步研究细胞周期进程与细胞周期相关蛋白的关系。总之，LDR对肿瘤细胞周期影响机制的研究有待进一步深入。
【参考文献】
［1］魏道严,金敖兴,黄帼,等. 小剂量辐射对小鼠肿瘤的抑制作用[J]. 中华放射肿瘤学杂志, 1995,4(4)：261.
［2］于洪升,卢彦达. 低剂量辐射对小鼠种植瘤的生长及红细胞免疫SOD活性的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2001,21：354357.
［3］周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.
［4］JOMER M C. Hypersensitivity to very low single radiation dose: its relationship to the response induced radioresistance[J]. Matation Res, 1996,385:171183.
［5］叶飞,刘树铮. X射线全身照射对小鼠脾细胞cyclin B 和cdc2基因转录水平的影响[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2001,19(3)：181184.
［6］谢大兴,冯永东,张鹏. 不同剂量X射线对细胞周期细胞凋亡的影响检测点和细胞凋亡的影响[J]. 中华实验外科杂志, 2005,23:798800.
［7］郭建华. cyclin E与恶性肿瘤[J]. 肿瘤研究与临床, 2003,15(1)：6871.
［8］于洪升,费从合,沈方臻,等. 低剂量辐射对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白bc12的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2003,23：171174.
［9］李福宝,于洪升. 低剂量辐射对荷S180肉瘤小鼠肿瘤组织HIF1α和P53表达的影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(3):189191.
［10］陈龙,黎福样,粱世雄. 低剂量辐射对小鼠移植性肝癌PCNA表达的影响[J]. 广西医科大学学报, 2000,17：766767.