血清IL10水平及其基因1082A/G位点单核苷酸多态性与胃窦癌恶病质的关系

【摘要】  　　目的 探讨胃窦癌病人血清细胞因子白细胞介素10（IL10）水平及1082A/G位点单核苷酸多态性与恶病质发生的关系。方法 采用放射免疫学方法检测150例胃窦癌病人及135例健康人（对照组）血清IL10水平。用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法检测胃窦癌病人IL10基因1082A/G位点单核苷酸多态性。结果 胃窦癌病人血清IL10水平较对照组显著升高（Z=-11.862,P<0.001），胃窦癌Ⅲ、Ⅳ期病人血清IL10水平较Ⅰ、Ⅱ期显著升高（Z=-10.028,P<0.001）。胃窦癌恶病质病人血清IL10水平较非恶病质病人显著升高(Z=-10.369,P<0.001)。Logistic 回归分析显示，IL10为恶病质发生的高风险性因素(OR=1.559，95%CI=1.299～1.870，P<0.001)。单核苷酸多态性分析显示，胃窦癌恶病质病人IL10基因1082G等位基因频率较非恶病质病人显著升高(χ2=3.953,P<0.05)。胃窦癌恶病质病人IL10基因1082AG基因型频率较非恶病质病人显著升高(χ2=4.511，P<0.05)。Logistic回归分析显示，校正肿瘤分期后，IL10基因1082AG基因型为胃窦癌恶病质的高风险性因素(OR=2.295,95%CI=1.029～5.117,P<0.05)。结论 血清IL10水平高及IL10基因1082AG基因型与胃窦癌病人恶病质的发生具有相关性。

【关键词】  白细胞介素10；多态性，单核苷酸；胃肿瘤；恶病质

　　ASSOCIATION OF IL10 LEVELS AND1082A/G  MONONUCLEOTIDE POLYMORPHISM WITH CACHEXIA IN PATIENTS WITH CANCER OF GASTRIC ANTRUM

　　SUN FENGBO, ZHANG DIANLIANG, ZHENG HONGMEI, et al

　　(Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To explore the association of serum level of interleukin10 (IL10) and1082 A/G mononucleotide polymorphism (SNP) in patients with cachexia caused by cancer of gastric antrum. Methods Radioimmunoassay was used toexamine the serum level of IL10 in 150 cancer patients and 135 healthy controls. The SNP of IL10 gene1082G/A was analyzedusing polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP).  Results The serum IL10 was significantly higher in the patients than in controls(Z=-11.862,P<0.001). The serum IL10 in patients with stageⅢ/Ⅳ cancer was significantly higher than that in patients with stageⅠ/Ⅱ(Z=-10.028,P<0.001). The serum IL10 in cachectic patients was significantly higher than that in noncachectic patients (Z=-10.369,P<0.001). Logistic regression analysis showed that IL10 was associated with an odds ratio of  1.599 (95%CI=1.299-1.870,P<0.001) for cachexia. SNP analysis showed that a significantly increased frequency of1082G allele was noted in patients with cachexia compared with patients without cachexia (χ2=3.953,P<0.05). The frequency of1082AG genotype was significantly elevated in the cachectic than those without (χ2=4.511,P<0.05). In a logistic regression analysis adjusted for carcinoma staging, the1082AG genotype was associated with an odds ratio of 2.295 (95% CI=1.029-5.117,P<0.05) for cachexia.  Conclusion High serum levels of IL10 and1082AG genotype are associated with the occurrence of cachexia in patients with cancer of gastric antrum.
   
　　［KEY WORDS］ interleukin10; polymorphism, sononucleotide; stomach neoplasms; cachexia
   
　　癌性恶病质是肿瘤病人死亡的重要原因之一，约22％的肿瘤病人直接死于恶病质[1]。其发生的确切机制至今尚不十分清楚，但越来越多的研究结果表明，多种细胞因子及其基因多态性，如肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)1、IL6、IL8及IL10，在恶病质的发生发展过程中起重要作用[24]。本文探讨了血清IL10水平及其1082A/G位点单核苷酸多态性与胃窦癌恶病质的关系，现报告如下。

　　1  对象与方法

　　1.1  研究对象
   
　　2008年9月—2009年2月，选择在我院普外科住院的原发性胃窦癌病人150例，男95例，女55例，年龄49～75岁，平均（60.5±8.6）岁。所有病人均经病理检查证实为胃窦部腺癌，并排除以下病人：①患有神经性厌食、炎性肠病、免疫性疾病和内分泌疾患；②心力衰竭(心功能大于3级)、肝衰竭(Child分级C级)、肾衰竭；③感染；④年龄大于75岁；⑤幽门梗阻；⑥近4个周接受过外科治疗、内镜支架置入术、放射治疗或化学治疗；⑦接受过可以严重影响新陈代谢或体质量的药物治疗。依照国际抗癌联盟(UICC)制定的指南对肿瘤进行TNM分期[5]，将胃窦癌病人近6个月体质量下降>10%且入院时血清C反应蛋白（CRP）>10 mg/L者诊断为恶病质[6]。恶病质病人71例，非恶病质病人79例，胃窦癌恶病质组Ⅲ、Ⅳ期病人显著多于非恶病质组（P<0.001）；两组性别构成、年龄、体质量及厌食情况，差异无显著性（P>0.05）。见表1。选择同期在我院行健康查体者135例作为对照组，男96例，女39例，年龄39～75岁，平均（58.6±9.6）岁。胃窦癌组与对照组的性别构成和平均年龄差异均无显著性。所有研究对象入组前均取得病人或家属的知情同意,并经过医院伦理委员会批准。表1  胃窦癌病人恶病质组与非恶病质组一般情况比较（略）

　　1.2  IL10检测方法
   
　　采集受检者清晨空腹肘静脉血5 mL,常规分离血清,分装,-20 ℃保存，集中检测 IL10含量。IL10检测采用放射免疫方法，试剂盒由北京华英生物技术研究所提供,严格按试剂盒说明书操作。

　　1.3  IL10基因1082A/G位点单核苷酸多态性检测方法
   
　　采集受检者外周静脉血，EDTA抗凝处理，离心，置于-70 ℃冰箱储存。用 Wizard基因组DNA提取试剂盒(Promega公司)，按照说明书提取白细胞基因组DNA。采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法检测病人IL10基因1082A/G位点单核苷酸多态性。PCR引物参照文献[7]进行设计。上游引物：5′CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT3′;下游引物：5′GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件: 94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物与5 U限制性内切酶EcoNⅠ（购于NEB公司）37 ℃条件下温浴过夜，30 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物：若IL10基因1082位点为等位基因A，则显示为280 bp和97 bp 两种片段；若1082位点为等位基因G，则显示为 253、97和27 bp等3种片段。

　　1.4  统计学处理
   
　　采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[8]统计学软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示,组间比较采用两独立样本t检验或MannWhitney U检验；计数资料比较采用χ2检验；组间基因型及等位基因频率分析根据情况采用χ2检验或相关校正检验法；危险性采用Logistic回归分析。

　　2  结果

　　2.1  胃窦癌恶病质组和非恶病质组血清IL10水平比较
   
　　胃窦癌组病人血清IL10水平为（73.004±22.144） μg/L，对照组为（36.993±16.042）μg/L, 两组比较，差异有极显著意义（Z=-11.862,P<0.001）。胃窦癌Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ期病人血清IL10分别为（57.075±13.951）、（91.702±13.727）μg/L，胃窦癌Ⅲ、Ⅳ期水平较Ⅰ、Ⅱ期显著升高，差异有显著性（Z=-10.028,P<0.001）。胃窦癌恶病质病人血清IL10水平为(91.727±13.576)μg/L,非恶病质病人为(56.176±12.860)μg/L,两组比较差异有显著性（Z=-10.369,P<0.001)。以血清IL10水平和胃窦癌分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）为自变量、以恶病质有无（无=0，有=1）为应变量进行Logistic回归分析，结果显示，细胞因子IL10为胃窦癌恶病质发生的高风险性因素(OR=1.559，95%CI=1.299～1.870，P<0.001)。

　　2.2  IL10基因1082A/G位点单核苷酸多态性与胃窦癌恶病质的关系
   
　　各组IL10基因1082 位点的基因型分布经χ2检验均符合HardyWeinberg平衡定律（P>0.05），说明资料的代表性良好。胃窦癌恶病质病人IL10基因1082G等位基因频率为14.8%，较胃窦癌非恶病质病人的7.6%显著升高(χ2=3.953,P<0.05)；胃窦癌恶病质病人IL10基因1082AG 基因型频率为29.6%，较胃窦癌非恶病质病人的15.2%显著升高(χ2=4.511，P<0.05)。 以IL10基因1082位点基因型和胃窦癌分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）为自变量、以恶病质有无（无=0，有=1）为应变量行Logistic回归分析显示，经过校正检验后IL10基因1082AG 基因型为胃窦癌恶病质的高风险性因素(OR=2.295,95%CI=1.029～5.117,P<0.05)。 齐鲁医学杂志2010年6月第25卷第3期  Med J Qilu, June 2010, Vol.25, No.3

　　3  讨论
   
　　癌性恶病质是以短期内体质量严重下降,脂肪和肌肉群进行性消耗为特征,同时伴有厌食、贫血、水肿、多脏器衰竭等表现的综合征。癌性恶病质发生与营养摄入不足、肿瘤消耗、肿瘤诱导机体代谢异常等多种原因有关，但其确切机制至今尚不十分清楚。近年的研究发现,引起癌性恶病质的主要原因为肿瘤释放某些因子及机体对肿瘤的免疫与炎症反应，尤以细胞因子的作用最为重要[9]。细胞因子与癌性恶病质的关系已成为当前研究的热点。文献报道，多种细胞因子被证实与癌性恶病质的发生发展有关，如TNFα、IL1、IL6、IL8及IL10[24]。
   
　　IL10是一种多功能免疫调节因子，具有抑制免疫与促进免疫的双重作用[10]。已有研究报道，IL10过量表达与多种恶性肿瘤有关，包括胃癌[11]。本研究证实，胃癌病人血清IL10水平明显高于健康人,且胃窦癌Ⅲ、Ⅳ期病人血清IL10水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期。表明血清IL10水平升高与胃窦癌的发生及扩散、转移密切相关。因此，检测胃窦癌病人血清IL10水平的动态变化，对判断胃窦癌临床分期及估计病情的进展有一定的意义。
   
　　有关血清IL10水平与癌性恶病质关系的报道较少，SHIBATA 等[4]报道结肠癌恶病质病人体内IL10水平显著升高，但该研究中仅22例恶病质病人，样本量偏小。近期国外有研究报道，导致IL10高表达的1082GG基因型与胃癌恶病质的发生有关。推测体内IL10过量表达可引发全身炎症反应，从而导致恶病质的发生。但该研究未检测恶病质病人血清IL10的水平[12]。本研究结果显示，胃窦癌恶病质病人血清IL10水平较非恶病质病人显著升高。提示血清IL10水平可能与胃窦癌恶病质的发生有关。同时，本文检测结果显示，胃窦癌Ⅲ、Ⅳ期病人恶病质的发生率较Ⅰ、Ⅱ期病人显著升高，提示胃窦癌分期可能与恶病质的发生有一定的关系。Logistic回归分析显示，校正胃窦癌分期后， IL10过量表达与胃窦癌恶病质的发生密切相关。
   
　　同时，本文检测了150例胃窦癌病人IL10基因1082位点单核苷酸多态性，结果显示，IL10基因1082G等位基因频率在恶病质病人中明显升高。胃窦癌恶病质病人IL10基因1082AG 基因型频率较非恶病质病人显著升高，提示可能与胃窦癌恶病质有关。通过Logistic回归分析校正了两组病人的肿瘤分期后显示，IL10基因1082AG 基因型为胃窦癌病人恶病质的高风险性因素。结合前面的实验结果，我们推测IL10基因1082AG 基因型可升高血清IL10水平，从而影响胃癌恶病质的发生。这与DEANS等[12]的研究结果相似。
   
　　值得注意的是，本研究未显示IL10基因1082位点GG基因型，这与美国人及英国人的报道明显不同，但与国内相关报道一致[13]。表明IL10基因多态性在不同地区、不同人种之间存在显著差异。
   
　　综上所述，血清细胞因子IL10的高水平及IL10基因1082位点单核苷酸多态性与胃窦癌恶病质的发生发展有关。但本研究样本量相对较少，因此有关细胞因子及其基因多态性在恶病质发生发展中的确切作用有待于进一步研究。

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