点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨可溶性endoglin（sEng）在子痫前期病人胎盘组织中的表达及其与子痫前期发病的关系。方法 2008年7月—2009年2月,选取在我科住院分娩的子痫前期病人67例,其中轻度31例（轻度子痫前期组），重度36例（重度子痫前期组）。选取同期正常晚期妊娠妇女39例为对照组。酶联免疫吸附试验检测各组血清中sEng水平；采用RTPCR、免疫印迹法分别检测各组胎盘组织中sEng mRNA以及蛋白表达水平。结果 轻度及重度子痫前期组血清sEng水平、胎盘组织sEng mRNA及蛋白表达水平明显高于对照组（F=133.54～779.63，q=13.26～53.88，P<0.01），且重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组（q=8.59～16.79，P<0.01）。轻度及重度子痫前期组血清sEng水平与胎盘组织sEng mRNA及蛋白表达水平呈正相关（r=0.781～0.888，P<0.01）。结论 子痫前期病人胎盘组织sEng mRNA及蛋白表达上调，导致血清sEng水平升高，从而参与子痫前期的病理生理过程。
【关键词】 子痫；先兆子痫；胎盘；受体，细胞表面；抗原，CD
EXPRESSION OF SOLUBLE endoglin IN PLACENTA OF PATIENTS WITH PREECALMPSIA XING BAOXIANG, CHEN WEIPING, PENG WEI, et al (Department of Obstetrics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To study the expression of soluble endoglin (sEng) in placenta of patients with preecalmpsia. Methods Sixtyseven patients with preeclampsia, who had a childbirth at our department from July 2008 to February 2009, were enrolled in this study. Of whom, 31 were mild and 36 were severe, and 39 healthy pregnant women of the corresponding time period were served as controls. Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure the serum levels of sEng, semiquantitative RTPCR and western blot to detect the expressions of sEng mRNA and sEng protein in placenta. Results The levels of sEng in serum and expressions of sEng mRNA and sEng protein in placenta in both mild and severe cases were higher than those of the controls (F=133.54-779.63;q=13.26-53.88;P<0.01), and above parameters of the severe cases were higher than those of the mild ones (q=8.59-16.79,P<0.01). The levels of sEng in serum showed a positive correlation with the expressions of sEng mRNA and sEng protein in placenta for both mild and severe preeclampsia (r=0.781-0.888,P<0.01). Conclusion Up regulation of the expressions of sEng mRNA and sEng protein in placenta results in the elevation of serum sEng, which involve in the pathophysiological process of preeclamsia.
［KEY WORDS］ eclampsia; preeclampsia; placenta; receptor, cell surface; antigen,CD
妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，其病因及发病机制尚不清楚。近年来研究表明，滋养细胞侵袭能力减低，胎盘浅着床与子痫前期发病密切相关。endoglin(CD105)是一种整合于膜上的跨膜糖蛋白，是转化生长因子β（TGFβ）受体家族的辅助蛋白质，通过调节细胞对TGFβ的反应，参与血管发育和重塑。可溶性endoglin （sEng）为CD105的可溶性形式，已有研究结果证实sEng与子痫前期发病关系密切[1]。本研究通过对子痫前期病人胎盘组织sEng mRNA及蛋白表达水平进行检测，探讨子痫前期病人胎盘组织sEng表达水平的变化及其与子痫前期发病的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
2008年7月—2009年2月，选择在我科住院分娩的子痫前期病人67例, 子痫前期的诊断标准参照《妇产科学》（第7版）[2]。其中轻度子痫前期病人31例（轻度子痫前期组），年龄为（28±3）岁，孕周（36.9±2.8）周;重度子痫前期病人36例（重度子痫前期组），年龄（29±3）岁，孕周（35.9±2.3）周。选取同期正常晚期妊娠妇女39例作为对照组，年龄为（29±4）岁，孕周（38.6±2.5）周。各组孕前均无原发性高血压、糖尿病、慢性肾炎、甲状腺功能亢进症、肝炎及结核等急慢性病史，各组年龄差异无显著性(P>0.05),对照组孕周明显高于轻度及重度子痫前期组(t=2.68、4.86，P<0.01)。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
分娩前1周内临床用药前采集各组空腹肘静脉血5 mL，分离血清，-20 ℃冰箱保存待测。于胎盘娩出后30 min内，立即在无菌状态下取两块母体面胎盘组织(避开钙化区和坏死区)，每块约1 cm×1 cm×1 cm大小，-70 ℃冰箱保存。
1.2.2 血清sEng水平检测
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，ELISA试剂盒购自美国DR公司,操作按说明书进行。标本均为同批测定，批内变异＜5%。
1.2.3 胎盘组织sEng mRNA表达的检测
采用RTPCR法。总RNA提取试剂盒由日本TAKARA公司提供,按逆转录酶第1链cDNA合成试剂说明书操作，将组织总RNA逆转录为cDNA。建立20 μL PCR反应体系。sEng扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后按94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72℃ 30 s,共35个循环；再72 ℃充分延伸10 min。内参照葡萄糖磷酸脱氢酶（GAPDH）扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后按94 ℃ 30 s, 62 ℃ 30 s, 72℃ 30 s,共35个循环；再72 ℃充分延伸10 min。根据Premier 5.0软件设计引物, sEng 上游引物为：5′ATCCCACTGCACTTGGCCTAC3′,下游引物为：5′TTCCAGCATGCAGAAGGACAG3′,扩增产物的长度为216 bp；内参照GAPDH 上游引物为：5′TCATGGGTGTGAACCATGAGAA3′,下游引物为：5′GGCATGGACTGTGGTCATGAG3′，扩增产物长度146 bp。以上引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物,电泳结果用计算机扫描分析,以各检测标本sEng以及GAPDH扩增条带的实际灰度值的比值表示sEng的表达水平。
1.2.4 胎盘组织sEng蛋白表达检测
采用免疫印迹法。按蛋白裂解液说明书（浙江碧云天公司产品）抽提、浓缩得到蛋白样本,蛋白样本电泳后,转移至蛋白转印膜上,封闭液（浙江碧云天公司产品）封闭2 h，加入1∶200一抗(兔抗人sEng,美国Santa Cruz公司产品) 4 ℃过夜，Western洗涤液（浙江碧云天公司产品）洗涤，加入1∶1 000二抗（鼠抗兔,丹麦Dako Cytomation 公司产品）孵育2 h后，弃去二抗, Western洗涤液洗涤。增强化学荧光发光法（ECL）显影，X线曝光30 s，X线片经激光扫描仪行定量分析。以同一张膜上β肌动蛋白（βactin）为内参照进行比较，以各标本sEng与βactin 实际灰度值的比值表示sEng蛋白表达水平。
1.3 统计学方法
应用SPSS 13.0及PPMS 1.5[3]统计软件进行数据处理，组间比较采用t检验、方差分析，相关性检验采用Pearson相关性分析。
2 结果
2.1 各组血清sEng水平比较
轻度子痫前期组及重度子痫前期组病人的血清sEng水平均高于对照组，差异有统计学意义（F=133.54，q=13.26、22.91，P<0.01）,而且重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组（q=8.59，P<0.01）。见表1。 表1 各组血清、胎盘组织sEng表达水平比较（略）
2.2 各组胎盘组织中sEng mRNA及蛋白表达水平比较
轻度子痫前期组及重度子痫前期组病人胎盘组织中sEng mRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组（F=779.63、373.26，q=19.94～53.88，P<0.01），且重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组（q=13.64、16.79，P<0.01）。见表1，图1、2。
2.3 血清sEng水平与胎盘sEng mRNA及蛋白表达水平的相关性
对照组血清sEng水平与胎盘sEng mRNA及蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.797、0.713，P<0.01)；轻度及重度子痫前期组血清sEng水平与胎盘组织sEng mRNA及蛋白表达水平呈正相关（r=0.781～0.888，P<0.01）。
3 讨论
3.1 子痫前期病人血清sEng水平变化及意义
endoglin是一种相对分子质量为18万的存在于细胞表面的同源二聚体跨膜糖蛋白，是TGFβ1和β3型受体复合体成分之一，主要表达于正常血管内皮细胞、合体滋养细胞和肿瘤血管。CD105的功能与TGFβ及其受体密切相关，TGFβ调节细胞增殖、分化，影响细胞外基质代谢，可调节血管生成和血管壁结构的完整性。sEng作为CD105的可溶性形式，是其氨基末端裂解重组的截短形式，可以通过抑制细胞对TGFβ的反应，参与血管发生和发育。
关于sEng与子痫前期的关系已有报道, VENKATESHA等[4]通过动物实验发现，经腺病毒表达体系将sEng转染孕鼠，结果出现高血压、血管形成障碍、血管通透性增加等效应，而与可溶性血管内皮生长因子受体1(sFlt1)共同转染时这一效应被扩大，并出现HELLP综合征(溶血、肝酶升高和血小板减少）、胎儿生长受限等类似人类子痫前期症状,并且血清sEng的水平越高病情越重。SALAHUDDIN等[5]研究了子痫前期、妊娠高血压、慢性高血压及正常妊娠血清sEng水平变化，结果显示仅子痫前期病人血清sEng水平明显升高。本研究结果亦表明，轻度及重度子痫前期病人血清sEng水平明显高于正常妊娠妇女，而且重度病人明显高于轻度病人。提示sEng在子痫前期病程的进展中发挥作用。sEng参与子痫前期的病理生理过程的机制并不十分清楚。VENKATESHA等[4]研究结果显示，sEng可与循环中TGFβ1结合，阻止TGFβl与血管内皮细胞膜上TGFβ受体结合，导致TGFβ信号传导被阻断，引起一氧化氮合成酶（NOS）中的Thr495去磷酸化异常，导致NOS激活被抑制，NO生成减少，引起血管舒缩失调。此外，尚有研究认为，TGFβ作为血管形成的重要调节因子，其细胞内信号传导阻断后，不仅影响微血管的形成，而且可以造成血管内皮损伤，影响血管的稳定性，造成血管通透性增加。
3.2 子痫前期病人胎盘组织sEng表达水平的变化及意义
关于子痫前期病人胎盘sEng mRNA及蛋白表达水平的变化报道较少， GU等[6]研究结果表明，子痫前期病人胎盘sEng mRNA及蛋白表达水平明显高于正常妊娠。本研究通过对正常晚期妊娠和子痫前期病人胎盘组织中sEng mRNA以及蛋白表达水平的检测显示，轻度及重度子痫前期病人胎盘组织中sEng mRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组，而且重度子痫前期病人又明显高于轻度子痫前期病人。提示胎盘组织sEng高表达可能在子痫前期病理生理过程中发挥重要作用。本研究结果同时显示，子痫前期病人胎盘组织sEng表达水平与血清sEng水平有明显相关性，提示胎盘组织可能是血循环中sEng的主要来源。STAFF等[7]对母体血清、脐血及羊水sEng水平的检测结果亦提示，血循环中sEng主要来源于胎盘。STEPAN等[8]研究了子宫动脉血流异常的中期妊娠妇女血清sEng水平，结果显示，sEng水平升高先于子痫前期症状出现。ROMERO等[9]一项巢式病例研究亦证实，子痫前期病人血清sEng水平在其临床症状出现前2～3个月即已升高， 因此可以推测胎盘组织sEng表达上调，导致血清sEng水平升高，这可能是子痫前期发病原因之一。
胎盘组织中sEng参与子痫前期发病的机制并不十分清楚,TGFβ作为血管发生的重要调节因子，在胎盘血管的形成及发育中发挥重要作用，子痫前期病人胎盘组织sEng表达上调，阻断了TGFβ信号传导系统，从而导致胎盘血管发生和发育异常。此外，CANIGGIA等[10]通过体外实验证实，sEng还是调节滋养细胞分化和浸润的关键负性调节因子，sEng表达上调可影响滋养细胞的浸润能力，导致胎盘浅着床，进而诱发子痫前期。YINON等[11]研究表明，在氧张力较低的妊娠4～9周时绒毛组织sEng表达水平明显升高，而在氧张力较高的妊娠10周以后其表达水平则明显减低，提示低氧可上调胎盘组织sEng的表达，而子痫前期存在胎盘缺血、低氧，因此子痫前期胎盘组织sEng表达水平升高亦可能是继发事件。
总之，本研究结果显示，子痫前期病人胎盘组织sEng mRNA及蛋白表达上调，导致血清sEng水平升高，从而参与了子痫前期的病理生理过程。但胎盘组织sEng表达的调节机制以及sEng诱发子痫前期的机制尚需进一步研究。
【参考文献】
[1] RANA S, KARUMANCHI S A, RICHARD J, et al. Sequential changes in antiangiogenic factors in early pregnancy and risk of developing preeclampsia[J]. Hypertension, 2007,50：137142.
[2] 乐杰. 妇产科学[M]. 7版.北京:人民卫生出版社, 2008:9395.
[3] 周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.
[4] VENKATESHA S, TOPORSIAN M, LAM C, et al. Soluble endoglin contributes to the pathogenesis of preeclampsia[J]. Nat Med, 2006,12：642649.
[5] SALAHUDDIN S, LEE Y, VADNAIS M, et al. Diagnostic utility of soluble fmslike tyrosine kinase 1 and soluble endoglin in hypertensive diseases of pregnancy[J]. Am J Obstect Gynecol, 2007,197：28.
[6] GU Y, DAVID F, LEWIS, et al. Placental productions and expressions of solubleendoglin, soluble fmslike tyrosine kinase receptor1,and placental growth factor in normal and preeclamptic pregnancies[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2008,93:260266.
[7] STAFF A C, BRAEKKE K, JOHNSEN G M, et al. Circulating concentrations of soluble endoglin (CD105) in fetal and maternal serum and in amniotic fluid in preeclampsia[J]. Am J Obstet Gynecol, 2007,197:176.
[8] STEPAN H, GEIPEL A, SCHWARZ F, et al. Circulatory soluble endoglin and its predictive value for preeclampsia in secondtrimester pregnancies with abnormal uterine perfusion[J]. Am J Obstet Gynecol, 2008,198:175.
[9] ROMERO R, NIEN J K, ESPINOZA J, et al. A longitudinal study of angiogenic (placental growth factor) and antiangiogenic (soluble endoglin and soluble vascular endothelial growth factor receptor1) factors in normal pregnancy and patients[J]. The Fournal of MaternalFetal and Neonatal Medicine, 2008,21:923.
[10] CANIGGIA I, TAYLOR C V, RITCHIE J W, et al. Endoglin regulates trophoblast differentiation along the invasive pathway in human placental villous explants[J]. Endocrinology, 1997,138:49774988.
[11] YINON Y, NEVO O, XU J, et al. Severe intrauterine growth restriction pregnancies have increased placental endoglin levels[J]. Am J Pathol, 2008,172:7785.